結(jié)果表明，相比于未添加乳桿菌發(fā)酵的空白對(duì)照，除a1和a3外，其他32株乳桿菌產(chǎn)酸能力都較好，總酸含量顯著提高(P＜0.05)。分別經(jīng)a2，a11，c5，c10，c11，c13發(fā)酵菜籽粕后，總酸含量均從0.31%提高至1%以上，尤其經(jīng)c10發(fā)酵后，總酸含量最高，達(dá)到1.24%，與空白相比提高了300%。說明乳桿菌c10在菜籽粕中生長良好，且能利用菜籽粕中多種糖類發(fā)酵并產(chǎn)生大量酸性物質(zhì)，使得總酸含量大幅提高，因此選擇c10用于后續(xù)研究。

2.2 乳桿菌菌株鑒定

通過PCR對(duì)c10基因組中16S rDNA擴(kuò)增后送至擎科生物有限公司測序，將測序所得序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中已收錄DNA序列進(jìn)行BLAST對(duì)比，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。結(jié)果表明，c10為乳桿菌屬，與類食品乳桿菌( Lactobacillusparalimentarius DSM 13238)的相似性達(dá)99.37%，因此確定c10為類食品乳桿菌。

2.3 乳桿菌生長曲線

圖3為類食品乳桿菌生長曲線。結(jié)果表明，0～3h為生長延滯期，3h后，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，菌體濃度迅速增加。到12h后，可能進(jìn)入對(duì)數(shù)末期，菌體濃度緩慢增加。為保證接種的乳桿菌處于對(duì)數(shù)生長期，在后續(xù)試驗(yàn)中，均選擇培養(yǎng)12h的處于對(duì)數(shù)生長期的菌種活化液作為發(fā)酵菜籽粕種子液。

2.4 溫度對(duì)類食品乳桿菌發(fā)酵菜籽粕產(chǎn)酸的影響

圖4為類食品乳桿菌于不同溫度下發(fā)酵24h后菜籽粕中總酸含量變化情況。結(jié)果表明，37～40℃為發(fā)酵菜籽粕產(chǎn)酸的最佳溫度，當(dāng)發(fā)酵溫度低于37℃或高于40℃時(shí)，總酸含量顯著降低(P＜0.05)。可能由于溫度過低或過高，乳桿菌生長代謝、胞內(nèi)外酶活性受到抑制，從而影響產(chǎn)酸的相關(guān)代謝途徑，導(dǎo)致發(fā)酵后菜籽粕中總酸含量較低。

由于黑曲霉在發(fā)酵菜籽粕過程中能產(chǎn)生蛋白酶、纖維素酶等，發(fā)酵結(jié)束后進(jìn)一步提高溫度進(jìn)行酶解，可將菜籽粕中大分子營養(yǎng)物降解為小分子營養(yǎng)物。因此在第二步厭氧發(fā)酵(乳桿菌發(fā)酵)過程中，適當(dāng)提高環(huán)境溫度將有利于提高蛋白酶、纖維素酶活性，為乳桿菌提供大量可發(fā)酵碳氮源，促進(jìn)乳桿菌發(fā)酵菜籽粕產(chǎn)酸，同時(shí)利于蛋白酶將菜籽粕中大分子蛋白分解為小肽。由于39℃利于乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)酸，且與蛋白酶作用溫度接近，因此將39℃作為第二步乳桿菌發(fā)酵溫度。

2.5 混菌發(fā)酵結(jié)合兩步法對(duì)發(fā)酵菜籽粕總酸含量的影響

如圖5A所示，經(jīng)黑曲霉發(fā)酵后，總酸含量從0.37%提高至1.05%。由于黑曲霉可利用多種碳源發(fā)酵產(chǎn)生檸檬酸等有機(jī)酸，因此，在第一步黑曲霉有氧發(fā)酵中，菜籽粕中部分糖類被黑曲霉轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸，使得發(fā)酵后菜籽粕總酸含量提高。將黑曲霉發(fā)酵后的菜籽粕接種類食品乳桿菌進(jìn)行厭氧發(fā)酵后，總酸含量進(jìn)一步提高。厭氧發(fā)酵至3h時(shí)，總酸含量變化較小，發(fā)酵3h后，總酸含量被顯著提高，當(dāng)發(fā)酵至12h后，總酸含量無顯著變化(P＜0.05)。當(dāng)兩步法發(fā)酵至12h時(shí)，總酸含量達(dá)到2.74%，與黑曲霉單菌發(fā)酵和空白對(duì)照比較可知，其總酸含量分別提高160.95%和640.54%。將黑曲霉發(fā)酵后的菜籽粕進(jìn)行酶解后，總酸含量無顯著性差異(P＞0.05)，表明在酶解過程中，黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)生的酶不影響總酸含量，且在第二步乳桿菌厭氧發(fā)酵過程中，總酸含量的變化主要由乳桿菌發(fā)酵糖類產(chǎn)生有機(jī)酸引起。

圖5B為兩步法過程中的還原糖含量的變化情況。結(jié)果表明，發(fā)酵菜籽粕于39℃下進(jìn)行酶解后，還原糖含量明顯增加。當(dāng)酶解至12h時(shí)，菜籽粕中還原糖含量達(dá)到30.09mg/g，相比于黑曲霉有氧發(fā)酵結(jié)束后，還原糖含量提高了272.86%，延長酶解時(shí)間，還原糖含量無顯著差異(P＞0.05)。當(dāng)菜籽粕經(jīng)黑曲霉發(fā)酵后，仍有大量多糖未被降解，這些物質(zhì)在酶解階段能被黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)生的多糖水解酶水解，因此使得菜籽粕中還原糖含量明顯增加。當(dāng)接種類食品乳桿菌進(jìn)行厭氧發(fā)酵至12h后，還原糖含量為17.94mg/g，相比39℃酶解12h，還原糖含量下降了40.38%。在添加乳桿菌進(jìn)行厭氧發(fā)酵過程中，酶將多糖分解為還原糖的同時(shí)，乳桿菌利用這些還原糖發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)酸，因此相比酶解菜籽粕中，還原糖含量大幅下降，并且總酸含量明顯提高。

如圖5C所示，經(jīng)類食品乳桿菌單獨(dú)發(fā)酵菜籽粕24h，總酸含量提高至1.29%，延長發(fā)酵時(shí)間，總酸含量無顯著差異(P＞0.05)。兩步法縮短了乳桿菌發(fā)酵菜籽粕達(dá)到最大產(chǎn)酸量的時(shí)間，且相比類食品乳桿菌單獨(dú)發(fā)酵菜籽粕總酸含量提高了 112.40%。可能的原因是，在兩步發(fā)酵過程中，多種酶將菜籽粕中多種大分子物質(zhì)分解為小分子物質(zhì)，乳桿菌可利用的小分子營養(yǎng)物質(zhì)不斷增多，加快了其生長代謝速率，因此縮短了產(chǎn)酸時(shí)間，同時(shí)在此過程中還原糖含量不斷增加，經(jīng)乳桿菌發(fā)酵后，總酸含量進(jìn)一步提高。

2.6 混菌發(fā)酵結(jié)合兩步法對(duì)硫苷含量的影響

黑曲霉在發(fā)酵48h后進(jìn)入酶解階段，結(jié)果如表1所示，將黑曲霉發(fā)酵后的菜籽粕于39℃酶解后，硫苷含量明顯降低，經(jīng)酶解12h后，硫苷含量降低為13.29 μmol/g，隨著酶解時(shí)間的延長，其含量無顯著變化(P＞0.05)。此結(jié)果與黑曲霉一步發(fā)酵后接種乳桿菌于39℃發(fā)酵12h后的硫苷含量無顯著差異(P＞0.05)，表明類食品乳桿菌在第二步厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸過程中的相關(guān)代謝活動(dòng)不會(huì)對(duì)黑曲霉分泌的相關(guān)酶系分解硫苷產(chǎn)生影響。當(dāng)兩步發(fā)酵菜籽粕至12h后，硫苷、總酸含量均無顯著變化(P＞0.05)，因此在后續(xù)試驗(yàn)中僅關(guān)注兩步發(fā)酵12h后菜籽粕中酸溶蛋白及氨基酸態(tài)氮含量變化，確定兩步發(fā)酵的最佳發(fā)酵時(shí)間。

2.7 混菌發(fā)酵結(jié)合兩步法對(duì)酸溶蛋白和氨基酸態(tài)氮含量的影響

表2為混菌發(fā)酵結(jié)合兩步法對(duì)酸溶蛋白和氨基酸態(tài)氮含量的影響。結(jié)果2.5表明，經(jīng)兩步發(fā)酵12h后，總酸含量不再隨發(fā)酵時(shí)間延長而變化，但酸溶蛋白、氨基酸態(tài)氮含量均隨發(fā)酵時(shí)間延長而增加。當(dāng)發(fā)酵至18h后，酸溶蛋白及氨基酸態(tài)氮含量分別提高至19.08%和1.23%，且不隨發(fā)酵時(shí)間延長而改變(P＞0.05)，相比黑曲霉單步發(fā)酵后分別提高78.48%和68.27%。因此確定兩步發(fā)酵的最佳發(fā)酵時(shí)間為18h。之前的研究表明，將黑曲霉發(fā)酵后的菜籽粕進(jìn)一步酶解后，由于菜籽粕中大分子蛋白被黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)生的相關(guān)蛋白酶分解，將大幅度提高菜籽粕中小分子蛋白含量。因此，在本研究中，將發(fā)酵的菜籽粕接種乳桿菌進(jìn)行兩步發(fā)酵后，總酸含量被提高的同時(shí)酸溶蛋白及氨基酸態(tài)氮含量也被大幅提高。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從泡菜水中篩選出一株高產(chǎn)有機(jī)酸的乳桿菌，經(jīng)16S rDNA測序鑒定為類食品乳桿菌(Lactobacillus paralimentarius)，并確定其發(fā)酵菜籽粕產(chǎn)酸的最佳條件。將乳酸菌與黑曲霉混合發(fā)酵同時(shí)結(jié)合兩步法作用于菜籽粕后，與空白對(duì)照和單菌發(fā)酵相比，其總酸含量分別提高了640.54%、160.95%和112.40%;酸溶蛋白和氨基酸態(tài)氮含量分別從2.87%和0.12%提高到19.08%和1.23%，其提高率達(dá)到了564.81%和925%;硫苷含量從23.09μmol/g下降到12.65μmol/g，其降解率為45.21%。以上結(jié)果表明，菜籽粕先經(jīng)黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)酶再接種乳桿菌兩步法處理后，硫苷含量顯著下降，菜籽粕的營養(yǎng)價(jià)值顯著提高，其品質(zhì)得到了很大的改善，對(duì)擴(kuò)大菜籽粕在食品和飼料中的開發(fā)與利用具有實(shí)際意義。

發(fā)酵完成的棉菜粕飼喂動(dòng)物技術(shù)

需要注意的是，發(fā)酵后的飼料酸度較低，不可以取代禽畜全部日糧。其他類發(fā)酵飼料同理。飼喂時(shí)根據(jù)不同情況，將發(fā)酵飼料按照一定比例添加到日糧中，發(fā)酵完成的棉菜粕為濕料，具體使用量每大概1.5-2公斤發(fā)酵棉菜粕（濕料）代替動(dòng)物日糧配方中1公斤豆粕的使用量進(jìn)行代替使用，與其它飼料混合后直接飼喂，由于棉菜籽粕蛋白較高，最高使用量不要超過禽畜日糧飼喂量的40%（濕料重量）。如果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵飼料過酸適口性變差，可在飼喂前在陽光下曬1-2小時(shí)，或添加適量的碳酸氫鈉（小蘇打）即可改善。

發(fā)酵過程中與發(fā)酵后使用過程中，發(fā)酵的容器要一直保持密封狀態(tài)，可以長時(shí)間保存（一年左右）。

當(dāng)前養(yǎng)殖業(yè)成本高居不下，而飼料成本是其中最高的，利用廉價(jià)原料發(fā)酵飼料（包括一些輕度發(fā)霉的粕類低價(jià)收回）是極佳解決辦法。通過微生物飼料發(fā)酵劑的發(fā)酵作用，可以將輕度霉變飼料變成優(yōu)質(zhì)飼料，將不易消化的物質(zhì)分解為可被畜禽吸收的小分子糖類、氨基酸等。同時(shí)發(fā)酵飼料中富含有益微生物、酶制劑、酸化劑等，可調(diào)節(jié)畜禽腸胃微生態(tài)環(huán)境并進(jìn)一步提高飼料利用率。發(fā)酵飼料氣味清香，提高了飼料的適口性，加上發(fā)酵飼料中有大約4℃的酒度，能夠促進(jìn)動(dòng)物新陳代謝促進(jìn)健康抵御疾病，是當(dāng)前養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展中重要的一環(huán)。

本技術(shù)也可以同樣發(fā)酵菜籽粕（餅）、棕櫚粕等，方法同上。

【視頻】部分發(fā)酵飼料養(yǎng)豬雞鴨帶給你無臭味健康無抗養(yǎng)殖效果

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