液體發酵飼料植物乳桿菌誘變育種的研究
導讀
目前，在不添加抗生素和促生長劑等有害添加劑條件下，提高畜產品品質成為迫切需要解決的問題。液體發酵飼料的研發為開辟綠色飼料提供了新的解決思路，作為一種新型飼料，液體發酵飼料在歐洲已得到廣泛應用，在斷奶仔豬上的優勢也被大量試驗結果所證明。
液體發酵飼料作為一種無抗飼料，在保留了固態飼料物理性質上優點的同時，具有使用安全、適口性好和動物喜采食等優點，可避免了仔豬挑食，還可提高仔豬采食量和生長性能，降低胃腸道pH值和大腸桿菌數量。另外，優質液態發酵飼料的pH應低于4.5，植物乳桿菌活菌數高于109CFU/mL，乳酸濃度高于150mmol/mL。高濃度的乳酸可降低飼料pH，有利于提高飼料適口性，抑制病原菌增殖。乳酸濃度高于7mmol/mL時，可抑制沙門菌增殖；乳酸濃度高于100mmol/mL時，可抑制大腸桿菌增殖。
本試驗液體飼料發酵用的植物乳桿菌是腸道常在菌，它可以減少賴氨酸的生物降解，提高飼料價值；改變腸道內環境，抑制有害菌繁殖；調整胃腸道菌群平衡，增強畜禽的免疫抗病能力；可提高畜禽的生長速度、奶肉蛋產量和飼料轉化利用率。因此植物乳桿菌可廣泛應用于動物飼喂、動物飼料和青貯飼料中，對畜牧業的生產有著重要意義。另外，菌種的好壞會直接影響液體發酵飼料的發酵效果和飼喂效果。有研究表明，酵母菌發酵會導致日糧的適口性降低，影響畜禽的采食量；原料中可能存在其他不適于發酵的菌種或者其含量太低不足以抑制有害菌的滋生。近年來，研究人員致力于研究自然存在的植物乳桿菌是否適合進行液體發酵飼料的有益微生物，在發酵系統中接種特定的有益菌是否會更好。因此，開發一種適宜的菌種，是液體發酵飼料的關鍵技術之一。
紫外線照射用于工業微生物菌種的誘變處理具有悠久的歷史，紫外輻照設備簡單、效果明顯，是微生物菌種選育的首選誘變因子。誘變育種是指有意識地將生物體暴露于物理的、化學的或生物的或多種誘變因子中，促使生物體發生突變，進而從突變體中篩選具有優良性狀的突變株的過程。遲乃玉等利用紫外線（UV），硫酸二乙酯（DES），亞硝基胍（NTG）復合誘變，篩選出一株超氧化物歧化酶（SOD）產量較高的乳酸菌菌株，但對植物乳桿菌進行誘變篩選高產乳酸菌株的相關研究并未見報道。通過篩選、馴化及生長促進因子的選擇來提高乳桿菌的產乳酸能力為一種行之有效的方法。對植物乳桿菌進行液體發酵，應精選產乳酸能力強、發酵速度快等性能指標優良的菌株。優良菌株的篩選和利用已經成為液體發酵前必須進行的一項基礎性工作，菌種的質量直接影響著液體飼料發酵的效果及最終發酵產品的質量。本研究對植物乳桿菌的細胞菌懸液進行紫外照射，選育具有良好發酵性能的液體發酵飼料專用乳酸菌，為液體發酵飼料的研制提供理論依據。
1試驗材料
1.1 出發菌株
植物乳桿菌1.1856（Lactobacillus plantarum）購于中國普通微生物菌種保藏中心（CGMCC）。
1.2 儀器設備
智能生化培養箱、恒溫儀、高速冷凍離心機、可見分光光度計、漩渦振蕩器、全溫振蕩器、電熱恒溫培養箱、座式自動電熱壓力蒸汽滅菌器、凈化工作臺、可見分光光度計、冰箱及生物實驗室常用設備等。
1.3 培養基及試劑
斜面及平板培養基：MRS肉湯培養基（購于索萊寶）加瓊脂和蒸餾水，調節pH至6.2±0.2。
初篩培養基：MRS肉湯培養基加碳酸鈣、瓊脂和蒸餾水，調節pH至6.2±0.2。
種子培養基：MRS肉湯培養基加蒸餾水，調節pH至6.2±0.2。
發酵全價料培養基：基礎日糧配方見表1。
乳酸測試盒：購于南京建成生物工程研究所。
試驗方法
2.1 菌種活化
取植物乳桿菌安瓿管，在超凈臺中用酒精脫脂棉對安瓿管外表面進行消毒后，用火焰加熱其頂端，滴少量無菌水至加熱的安瓿頂端使之破裂。將已經破裂的安瓿頂端敲下，取0.3 mL液體培養基滴入管內，輕輕震蕩，使凍干菌體溶解呈懸浮狀. 吸取全部菌懸液，移植于斜面中，37 ℃培養24 h，并連續兩次繼代培養。
2.2 選育種子液的制備
將已活化好的植物乳桿菌斜面挑取一環接種到液體培養基中，37 ℃條件下靜置培養24 h，然后從培養的菌液中取5%菌種，轉接到液體培養基中37 ℃靜置培養24 h，制成選育種子液。
2.3 生長規律曲線的測定
從上述培養的選育種子液中取5%菌種轉接到液體飼料中（V 水∶V 料=2.5∶1）進行培養試驗，以未接種的液體飼料作空白，采用比濁法測定，在波長600 nm條件下，分別測定該菌種在培養0、6、12、18、24、30、36、42、48 h后的吸光度值. 以培養時間為橫坐標，吸光度為縱坐標，作植物乳桿菌的生長曲線。
2.4 菌株的紫外誘變
取菌體斜面，在無菌條件下，加入無菌水5 mL，刮下表面培養物制成懸液，5000 r/min離心5 min，再用生理鹽水洗滌、離心2次. 用10倍稀釋法將菌懸液細胞稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7不同濃度，再各取5 mL置于直徑為9 cm的無菌平皿，內置一個消毒轉子，將盛有制備好的菌懸液的培養皿放在磁力攪拌器上，放置在紫外誘變箱中，利用15 W紫外燈，照射距離25 cm，設置照射時間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3 min6個梯度處理. 紫外照射后開啟紅光，分別吸取紫外照射的菌懸液0.1 mL涂布于MRS培養基上，每個稀釋度涂3個平板. 以同樣的操作方法，將未經紫外線處理的菌液稀釋涂布于MRS培養基上作為對照. 將上述涂勻的平板，用黑布裹好，置于37 ℃恒溫培養箱中避光培養24 h. 將培養好的平板取出進行計數，找出最佳照射劑量，致死率計算公式為：
致死率（%）=（紫外照射前菌液中活菌數-紫外照射后菌液中活菌數）/紫外照射前菌液中活菌數×100%.
2.5 篩選方法
2.5.1 MRS-CaCO3初篩
通過植物乳桿菌產生的乳酸溶解培養基中的碳酸鈣形成溶鈣圈大小，判定植物乳桿菌產乳酸能力的大小。
2.5.2 復篩
選取初篩產乳酸能力相對較高的幾株菌株，接種到液體發酵飼料中進行37 ℃振蕩培養，測定產生乳酸情況，篩選出產乳酸能力最大的菌株作為目標菌株。
2.6 菌株的穩定性試驗
將誘變菌株連續傳代發酵，每次傳代都要進行乳酸的測定，觀察誘變菌株產乳酸的穩定性。
2.7 乳酸的測定
采用乳酸測試盒。
3結果與分析
3.1 植物乳桿菌生長曲線
在菌種的誘變育種中，選擇處于對數生長期的生理狀態的菌體具有很重要的意義。 處于對數期的植物乳桿菌，其個體形態和生理特性等均較一致，并且生長旺盛、代謝活性強，細胞繁殖快，生命力強，重復性能較好，易引起變異。 同時為了保證處理時具有一定的細胞濃度，以增加可能變異的細胞總數，常選用對數生長中后期的細胞進行處理。 從圖1可以看出，該菌在培養至6~24 h時為對數生長期，之后開始進入穩定生長期。 所以選擇12~24 h處于對數生長期的菌懸液進行誘變選育。
3.2 紫外照射劑量的確定
利用紫外線照射誘變稀釋度為10-3 個/mL的植物乳桿菌細胞菌懸液，平板涂布培養進行菌落計數。不同的紫外線照射時間會造成不同的致死率，其致死率曲線關系見圖2。從圖2可看出，隨著紫外線照射時間的延長，植物乳桿菌的致死率逐漸增大，根據經驗，較高的致死率有利于篩選優良菌株；如果處理時間太長，一些高活性菌株也有可能致死，反而不利于篩選。 根據近年來對紫外線等多種誘變劑誘變效應的研究發現，正向突變較多地出現在偏低劑量中。 對于經多次誘變的菌株，在較低的誘變劑量時有利于正向突變，較多地出現在70%~80%致死率中。 設定以80%致死率時的照射時間作為最佳照射時間進行誘變。 從圖2中可以看出，當照射時間為2 min時致死率可達到82%，由此判定此時為最佳誘變時間，以后的試驗中誘變時間均選擇2 min。
3.3 MRS-CaCO3初篩結果
出發菌株的菌懸液經紫外誘變后稀釋涂布于MRS固體培養基上，培養后從MRS培養基上共分離得到79株長勢較好的白色單菌落，再根據MRS-CaCO3初篩培養基的溶鈣圈大小對此79株菌進行了初步篩選，從中篩選出10株正突變菌株，結果如圖3所示，兩個平板的中心都是原始菌株的菌落，原始菌種的周邊都是正突變菌種，其中左邊平板中有6株正突變菌種，右邊平板中有4株正突變菌種。
3.4 乳酸測定復篩結果
首先將初步篩選的10株菌分別接種于MRS固體培養基中，37 ℃培養24 h后，分別接入三角瓶中進行搖瓶培養，再按5%接種量將入選菌接入到液體發酵飼料中（配方見表1），37 ℃培養24 h，測定乳酸含量。 結果如表2。
3.5 突變菌株穩定性測定
將UR-3突變菌株連續傳代5次，每傳一代分別進行液體發酵試驗，從而測定發酵液中菌株的產乳酸含量，結果見表3。
上述各代的產乳酸能力差異不顯著（p>0.05），基本一致變化不大，這充分說明了該誘變菌株的遺傳穩定性好，不容易發生退變。
討論與結論
液體發酵飼料的發酵控制是一項極為關鍵的技術，特別是菌種的好壞，直接影響液體發酵飼料的飼喂效果。 為提高原始菌株的產乳酸能力，本研究選擇了常規紫外線做誘變因子進行誘變。 用于誘變育種的誘變因素有物理因素和化學因素。 在物理誘變因素中，紫外線比較有效、適用、安全，其他幾種射線都是電離性質的，具有穿透力，使用時有一定的危險性；化學誘變劑的突變率通常要比電離輻射高，并且十分經濟，但這些物質大多是致癌劑，使用時必須十分謹慎。 試驗中，在紫外燈功率和照射距離一定的情況下，通過改變紫外照射時間來獲得不同的誘變劑量，把正變率最高的照射時間確定為最佳誘變劑量，本試驗最終成功選育出一株高產乳酸的突變菌株UR-3，經5次傳代后，其乳酸高產性狀保持穩定。
在本研究中，菌種誘變處理完后，在分離、篩選正突變菌株的環節中，針對性地選擇MRS培養基作為誘變后的富集培養基，從中篩選出長勢良好的菌株作為初篩對象，大大減少了工作量。 種子液接種量直接影響菌株發酵產物的產量，因此在正突變株復篩的發酵培養過程中，應嚴格控制各菌株發酵液中種子液接種量，確保各菌株發酵液的種子液接種量一致。
綜上所述，通過紫外誘變植物乳桿菌的篩選方法，選育出高產乳酸的植物乳桿菌突變菌株UR-3，顯著地提高了產乳酸量（p<0.05），該菌株的遺傳穩定性良好，有助于后期培育。 在液體發酵飼料中，經紫外誘變后該菌株產乳酸的能力較出發菌株提高了44.53%，為后續的液體發酵飼料的研制提供了新的研究思路和方向。
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