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導(dǎo)讀

我國(guó)是世界上油茶品種最多、分布最廣、籽產(chǎn)量最高的國(guó)家，油茶籽、茶粕(即油茶籽榨油后剩下的渣)年產(chǎn)量分別為l00萬(wàn)、73萬(wàn)t左右。在我國(guó)江西、湖南等南方丘陵地區(qū)，油茶是一種重要的油料植物。

目前，我國(guó)茶粕大部分被用作清塘劑、肥料、燃料，甚至廢棄，僅少量用于茶皂素的提取，造成了資源浪費(fèi)，同時(shí)也污染了環(huán)境。茶粕中含有豐富的蛋白質(zhì)、糖類、粗纖維、灰分和茶皂素，利用價(jià)值較高，目前利用茶粕開發(fā)飼料的研究受到普遍關(guān)注。研究表明，茶粕纖維素含量較高，營(yíng)養(yǎng)水平較低，以及茶粕中茶皂素等抗?fàn)I養(yǎng)因子含量過(guò)高是限制油茶餅粕飼用的主要因素。為使茶粕變廢為寶，緩解目前我國(guó)蛋白飼料短缺的問(wèn)題，本試驗(yàn)以去除茶皂素的油茶餅粕為原料，采用多菌種組成的混合菌種進(jìn)行發(fā)酵，擬篩選出降低茶粕粗纖維含量、提高茶粕飼料適口性、增加茶粕菌體蛋白含量的優(yōu)良菌種。

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

白地霉、產(chǎn)朊假絲酵母、熱帶假絲酵母、黑曲霉、米曲霉、綠色木霉，均由廣東微生物研究所提供，依次用Y1、Y2、Y3、M1、M2、M3表示。其中，黑曲霉、米曲霉、綠色木霉能產(chǎn)生較豐富的纖維素酶、果膠酶、淀粉酶等酶類，可較好地降解纖維素等多糖并產(chǎn)生較多的還原糖；產(chǎn)朊假絲酵母、白地霉、熱帶假絲酵母則有利用還原糖能快速生長(zhǎng)的特點(diǎn)?？奢^大提高茶粕的菌體蛋白含量。通過(guò)不同菌群之間的組合，應(yīng)當(dāng)可以實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)匹配和“超產(chǎn)”的目標(biāo)。

1.1.2 儀器與設(shè)備

超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、電子天平、高壓蒸汽滅菌鍋、移液器、電熱恒溫干燥箱、電動(dòng)離心機(jī)、水浴鍋、電爐、試管、量簡(jiǎn)、燒杯、三角瓶、容量瓶等。

1.1.3 培養(yǎng)基

①斜面培養(yǎng)基，PDA培養(yǎng)基：用于霉菌培養(yǎng)；麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基：用于酵母菌培養(yǎng)。

②液體種子培養(yǎng)基，霉菌：葡萄糖2％，可溶性淀粉3.0％，蛋白胨0.15％ ，KH2PO40.3％，(NH4)2SO40.5％，MgSO40.15％，自來(lái)水1000mL。酵母菌：130g麥芽汁加水1000mL配成12oBx溶液，供酵母增殖用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 茶粕固體發(fā)酵培養(yǎng)基

茶粕12.5g，豬血粉2.5g，(NH4)2SO4 2％，KH2PO40.1％，MgSO40.05％。

1.2.2 發(fā)酵條件

250mL三角瓶，裝茶粕固體發(fā)酵培養(yǎng)基15g，加自來(lái)水20mL，殺菌后接種經(jīng)活化及擴(kuò)大培養(yǎng)的6種菌種的菌懸液(總接種量為15％，各菌種的接種比均為1:1)，在室溫下培養(yǎng)4d。

1.2.3 分析測(cè)定方法

培養(yǎng)結(jié)束后向三角瓶?jī)?nèi)加入蒸餾水200mL，30℃恒溫水浴浸提3h，過(guò)濾，所得濾液用于測(cè)定菌體干重。將濾液全部移入離心管中，3000r/min離心分離10min，再分離出上清液，保留管底沉淀物，用蒸餾水洗滌此沉淀物3次，收集到的即是微生物細(xì)胞。將微生物細(xì)胞置于65℃烘箱中烘干至恒重，稱重即為菌體干重。

2結(jié)果與分析

2.1 單菌種發(fā)酵

用250mL三角瓶裝茶粕固體發(fā)酵培養(yǎng)基15g，加水20mL，滅菌后接種單一菌種的菌懸液(接種量均為15％)，在室溫下培養(yǎng)4d。發(fā)酵結(jié)束后以收集到的菌體干重作為測(cè)試指標(biāo)，試驗(yàn)結(jié)果見圖1?？梢钥闯觯捎脝我痪N發(fā)酵茶粕培養(yǎng)基，收集到的菌體干重很少，最多僅為9.35g/L，這說(shuō)明采用單一菌種發(fā)酵茶粕時(shí)，茶粕和豬血粉中的營(yíng)養(yǎng)成分很難被利用，因而自身的生長(zhǎng)繁殖受到影響。為了大量培養(yǎng)菌種細(xì)胞，茶粕發(fā)酵時(shí)應(yīng)當(dāng)采用混合菌種進(jìn)行發(fā)酵，有效利用微生物的協(xié)同作用，促使各菌種在茶粕基質(zhì)中都能較好地生長(zhǎng)繁殖。

2.2 雙菌種發(fā)酵

用250mL三角瓶裝茶粕固體發(fā)酵培養(yǎng)基15g，加水20mL，滅菌后接種雙菌種的菌懸液(總接種量為15％，2種菌種的接種比為1:1)，在室溫下培養(yǎng)4d。發(fā)酵結(jié)束后以收集到的菌體干重作為測(cè)試指標(biāo)，試驗(yàn)結(jié)果見圖2?？梢钥闯觯捎秒p菌種發(fā)酵茶粕培養(yǎng)基，發(fā)酵后收集到的菌體干重在9.43～13.74g/L之間，大于單菌種發(fā)酵獲得的菌體干重四，這是因?yàn)槊咕徒湍妇g存在一種協(xié)同作用，霉菌能分泌淀粉酶、纖維素酶及蛋白酶等酶類，降解淀粉、粗纖維及粗蛋白等物質(zhì)，生成可被酵母菌直接利用的葡萄糖、氨基酸等小分子物質(zhì)，酵母菌則在這些小分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的作用下不斷生長(zhǎng)繁殖，使發(fā)酵后茶粕含有較多的菌體細(xì)胞。

2.3 三菌種發(fā)酵

用250mL三角瓶裝茶粕固體發(fā)酵培養(yǎng)基15g，加水20mL，滅菌后接種三菌種的菌懸液(總接種量為15％，3種菌種的接種比為1:1:1)。在室溫下培養(yǎng)4d。發(fā)酵結(jié)束后以收集到的菌體干重作為測(cè)試指標(biāo)，試驗(yàn)結(jié)果見圖3?？梢钥闯?，采用三菌種發(fā)酵茶粕培養(yǎng)基，發(fā)酵后收集到的菌體干重為10.66~18.91g/L，差別較大，其中混合菌種M3+Y1+Y2發(fā)酵茶粕后收集到的菌體干重可達(dá)18.91，菌體干重居首位，粗纖維含量也降低至10.54％。是三菌種發(fā)酵中最優(yōu)的菌種組合。

2.4 四菌種發(fā)酵

用250mL三角瓶裝茶粕固體發(fā)酵培養(yǎng)基15g，加水20mL。滅菌后接種四菌種的菌懸液(總接種量為15％，4種菌種的接種比為1:1:1:1)，在室溫下培養(yǎng)4d。發(fā)酵結(jié)束后以收集到的菌體干重作為測(cè)試指標(biāo)，試驗(yàn)結(jié)果見圖4?？梢钥闯?，4種菌種組成的混合菌種能更好地利用培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分來(lái)維持各菌種細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖，四菌種發(fā)酵可獲得的菌體干重總體上多于雙菌種發(fā)酵及三菌種發(fā)酵。

2.5 五菌種發(fā)酵

用250mL三角瓶裝茶粕固體發(fā)酵培養(yǎng)基15g，加水20mL，滅菌后接種五菌種的菌懸液(總接種量為15％，5種菌種的接種比為1:1:1:1:1)，在室溫下培養(yǎng)4d。發(fā)酵結(jié)束后以收集到的菌體干重作為測(cè)試指標(biāo)，試驗(yàn)結(jié)果見圖5。可以看出，采用五菌種發(fā)酵茶粕培養(yǎng)基，發(fā)酵后收集到的菌體干重要比四菌種發(fā)酵低，這說(shuō)明多菌種發(fā)酵時(shí)，并非菌種越多越好。因?yàn)榫N數(shù)增多．會(huì)消弱各菌種的優(yōu)勢(shì)，且容易感染雜菌，使培養(yǎng)的目的菌種不能較好地生長(zhǎng)繁殖，故導(dǎo)致菌體干重減少。

2.6 六菌種發(fā)酵

用250mL三角瓶裝茶粕固體發(fā)酵培養(yǎng)基15g，加水20mL，殺菌后接種六菌種的菌懸液(總接種量為15％，6種菌種的接種比為1:1:1:1:1:1)，在室溫下培養(yǎng)4d。發(fā)酵結(jié)束后以收集到的菌體干重作為測(cè)試指標(biāo)，復(fù)合菌種M1+M2+M3+Y1+Y2+Y3發(fā)酵茶粕收獲菌體干重為14.66g/L。可知6種菌種組成的混合菌種不適宜用來(lái)發(fā)酵茶粕，這是因?yàn)椴捎昧N發(fā)酵茶粕培養(yǎng)基，發(fā)酵后收集到的菌體干重較少，而粗纖維含量也較高。

3結(jié)論與討論

本試驗(yàn)在所選用的菌種范圍內(nèi)進(jìn)行了廣泛的篩選，試驗(yàn)結(jié)果表明，茶粕培養(yǎng)基在接入不同混合菌種進(jìn)行發(fā)酵后，都能獲得一定的菌體干重(或菌體蛋白)。但是菌體干重的含量差別較大，在6.57 ~ 20.55 g/L范圍內(nèi)變化，其中3種霉菌和1種酵母菌組成的混合菌種獲得菌體干重最多，尤以混合菌種M1+M2+M3+Y2獲得的菌體干重較多，可達(dá)20.55g/L左右．故該混合菌種是發(fā)酵茶粕和血粉生產(chǎn)微生物蛋白飼料的最佳菌種組合。