利用廢紙資源發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶研究及應(yīng)用

2021-06-07 15:35:39 點(diǎn)擊：

纖維素酶（β-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶）是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱，它不是單體酶，而是起協(xié)同作用的多組分酶系，是一種復(fù)合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、內(nèi)切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等組成，還有很高活力的木聚糖酶。作用于纖維素以及從纖維素衍生出來的產(chǎn)物。微生物纖維素酶在轉(zhuǎn)化不溶性纖維素成葡萄糖以及在果蔬汁中破壞細(xì)胞壁從而提高果汁得率等方面具有非常重要的意義。

纖維素酶是繼淀粉酶和蛋白酶之后的全球第三大工業(yè)用酶制劑，被廣泛地應(yīng)用于生物能源、食品、造紙、紡織洗滌、醫(yī)藥、動(dòng)物飼料以及農(nóng)業(yè)廢棄物處理等領(lǐng)域。但是昂貴的發(fā)酵生產(chǎn)成本是目前制約纖維素酶行業(yè)快速發(fā)展的主要瓶頸。而廢紙作為可回收利用的廢棄物資源之一，由于其纖維素含量高、價(jià)格低廉、來源廣泛、易獲取及產(chǎn)生量大等特點(diǎn)具有良好的開發(fā)應(yīng)用潛力。因此，利用廢紙資源進(jìn)行纖維素酶的發(fā)酵生產(chǎn)，不僅可以有效降低纖維素酶發(fā)酵成本，而且還能實(shí)現(xiàn)廢紙資源的高值化利用。

近日，中國科學(xué)院近代物理研究所生物物理室研究人員在利用廢紙發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶研究方面取得進(jìn)展。相關(guān)成果發(fā)表在環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域期刊Journal of Cleaner Production上。

研究人員利用重離子束誘變選育的長枝木霉突變菌株LC-M4進(jìn)行廢紙?zhí)荚窗l(fā)酵產(chǎn)酶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)選用的辦公廢紙、餐巾廢紙、雜志紙和硬紙板紙四種類型的廢紙中，硬紙板紙發(fā)酵的濾紙酶活（FPA）、內(nèi)切葡聚糖酶活（CMC）、β-葡萄糖苷酶活（BGL）和木聚糖酶活（Xyl）分別達(dá)到了2.97 IU/mL、4.8 IU/mL、0.51 IU/mL和382.59 IU/mL，表明LC-M4菌株可有效利用硬紙板紙為碳源產(chǎn)酶。通過廢紙結(jié)構(gòu)表征發(fā)現(xiàn)：不同廢紙中纖維素為主要成分，造紙過程中添加的碳酸鈣等填料可以為菌株生長和產(chǎn)物合成提供營養(yǎng)元素，對發(fā)酵過程有促進(jìn)作用。為進(jìn)一步提高廢紙?zhí)荚窗l(fā)酵酶活，選用硬紙板紙和麩皮混合碳源發(fā)酵，BGL最高達(dá)到0.80 IU/mL，比硬紙板紙單一碳源酶活提高了56.86%；外切葡聚糖酶活（pNPC）、FPA和Xyl也有了一定的提高，其中Xyl達(dá)到399.74 IU/mL，較微晶纖維素碳源發(fā)酵酶活（343.09 IU/mL）提高了16.51%。表明廢紙和麩皮作為產(chǎn)酶發(fā)酵碳源具有很高的應(yīng)用價(jià)值和市場開發(fā)潛力。

菌種選育

菌種選育是纖維素酶生產(chǎn)的基礎(chǔ)性工作，國內(nèi)外許多專家進(jìn)行了大量研究，為了生產(chǎn)高質(zhì)量的纖維素酶產(chǎn)品，王家林等（1996）在吸收國內(nèi)外經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，先后引進(jìn)了綠色木霉木10、綠色木霉Sn-91014、康氏木霉NT-15、黑曲霉XX-15A，在此基礎(chǔ)上，采用了紫外線、特定電磁波輻射、線性加速器，亞硝基胍等物理、化學(xué)的誘變方法，獲得了高產(chǎn)菌株NT15-H、NT15-H1、XT-15H、XT-15H1。其中木霉NT-15H固體培養(yǎng)活力經(jīng)輕工部食品質(zhì)量監(jiān)督檢測中心南京站檢測表明，濾紙活力為3670u/g, C1-酶活力24460u/g，Cx-酶活力1800u/g，已達(dá)到國際先進(jìn)水平。此菌種在工廠化生產(chǎn)中性能穩(wěn)定。張苓花等（1998）采用康氏木霉W-925，J-931，經(jīng)過濃度為2%硫酸二乙酯和紫外線（15W、30cm、2min）復(fù)合誘變后，得到了產(chǎn)酶活性高的Wu-932菌種，該菌種CMC糖化力達(dá)到2975，濾紙?zhí)敲富钚詾?31，比出發(fā)菌W-925分別提高了100%和81%。化工部飼料添加劑技術(shù)服務(wù)中心王成書等（1997）采用該中心的里氏木霉A3先進(jìn)行紫外線和亞硝基胍復(fù)合誘變后，將處理過的孢子接種于纖維雙層平板上，30℃培養(yǎng)5-8天，15℃放置7-10天，挑選透明圈直徑和菌落直徑比較大的單菌落進(jìn)行三角瓶固態(tài)發(fā)酵再篩選，得到了產(chǎn)纖維素酶活力很高的里氏木霉91-3菌株。

纖維素酶菌種易退化，退化后其產(chǎn)酶力明顯降低，其原因可能有三個(gè)方面：

①經(jīng)誘變篩選的菌種發(fā)生回復(fù)突變。

②自然負(fù)突變。

③菌種長時(shí)間低溫斜面保藏，會(huì)在分生孢子上長出次生菌絲，而次生菌絲所形成的分生孢子生命力弱，這可能是菌種退化的主要原因。為了避免纖維素酶菌種退化，張苓花等（1998）報(bào)道，采用砂土管保藏菌種。即將過篩洗凈的砂子與土以3：2比例混合分裝在試管內(nèi)，用1kg/cm2壓力滅菌30分鐘共三次，將欲保存的斜面菌種制備成1000ml孢子懸浮液，每個(gè)砂土管注入0.5ml，搖勻，放入盛有無水CaCl2真空干燥器內(nèi)保存。經(jīng)測定，在所測的121天內(nèi)，酶的活性基本不變；酶活性下降50%的時(shí)間，由常規(guī)方法的60天延長至160天，明顯地減緩了菌種退化速度。

發(fā)酵工藝

纖維素酶的生產(chǎn)工藝主要有兩種，即固體發(fā)酵和液體發(fā)酵，其工藝如下：

影響產(chǎn)酶量和活力的因素

影響纖維素酶產(chǎn)量和活力的因素很多，除菌種外，還有培養(yǎng)溫度、pH、水分、基質(zhì)、培養(yǎng)時(shí)間等。這些因素不是孤立的，而是相互聯(lián)系的。張中良等（1997）采用均勻設(shè)計(jì)Cl12(1210)，以綠色木霉（T.ViriclePers.expr）為菌種，研究了影響產(chǎn)纖維素酶的五大因素對產(chǎn)酶量和活力的作用，認(rèn)為基質(zhì)粗纖維含量為40%、初始pH7.5、加水4倍、在26-31℃條件下培養(yǎng)45h可獲得最大產(chǎn)酶量26mg/g和CMC酶活力20mg/g·h。王成華等（1997）也研究了其誘變篩選的里氏木霉91-3的產(chǎn)酶條件，結(jié)果表明該菌種以7：3的秸稈粉和麥麩，另添加4%硫酸銨、0.4%磷酸二氫鉀、0.1%硫酸鎂為最佳培養(yǎng)基，28-32℃為適宜培養(yǎng)溫度，30℃為最佳溫度，4%為最佳接種量，96h到達(dá)發(fā)酵高峰。張苓花等（1998）研究了以康氏木霉W-925為出發(fā)菌，經(jīng)誘變后得到的Wu-932纖維素酶高產(chǎn)菌的最佳發(fā)酵條件。結(jié)果表明，以1：2的麥麩和稻草粉為培養(yǎng)基，5%的接種量，稻草粉碎平均長度3-5mm，初始pH4-5，溫度在28-35℃，發(fā)酵時(shí)間72h為最佳發(fā)酵條件。

污染菌的控制

飼用纖維素酶普遍存在一種俗稱的“白毛菌”污染。污染后輕者酶活性下降，重者發(fā)酵失敗。為此，研究控制發(fā)酵污染意義很大。張苓花等（1998）研究“白毛菌”的菌落特征、來源、生長和生理特征及控制方法，找到了一種與康氏木霉Wu-932呈共生關(guān)系，而與“白毛菌”呈競爭性抑制關(guān)系的熱帶假絲酵母菌J-931。利用此菌進(jìn)行混合發(fā)酵，可有效地控制“白毛菌”的污染。

農(nóng)業(yè)應(yīng)用

纖維素酶在畜禽生產(chǎn)中的應(yīng)用：

常見的畜禽飼料如谷物、豆類、麥類及加工副產(chǎn)品等都含有大量的纖維素。除了反芻動(dòng)物借助瘤胃微生物可以利用一部分外，其它動(dòng)物如豬、雞等單胃動(dòng)物則不能利用纖維素。

以下是纖維素酶在牛、雞、豬日糧中的應(yīng)用：

牛日糧

焦平林等（1996）用閹牛試驗(yàn)，在日糧中按每頭每日添加纖維素酶40g，飼喂60天，結(jié)果表明加酶組日增重892.78g，對照組日增重746.8g，差異極顯著（P<0.01）。焦平林又用30頭荷斯坦奶牛進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)組按每頭每日添加50g纖維素酶，結(jié)果表明，試驗(yàn)組15頭奶牛在68天總產(chǎn)奶量為2916kg,而對照組15頭奶牛在68天的總產(chǎn)奶量為2689kg，差異顯著（P<0.05）。付連勝等（1998）報(bào)道，在瘤胃功能正常狀態(tài)下，成年奶牛及育成牛飼喂纖維素酶5天后，其糞便干物質(zhì)和飼喂前相比，減少30%，一周后，封閉式牛舍氨含量下降70%左右，粗飼料采食量提高8-10%，尿中尿素下降58.9%，懷孕奶牛在產(chǎn)前30天始飼喂纖維素酶，分娩后，不產(chǎn)生生理性消化不良癥狀，胎兒體重可增加1.5-3kg，并無畸形和弱胎。產(chǎn)牛體質(zhì)恢復(fù)快，產(chǎn)奶高峰維持時(shí)間長（一直至第四個(gè)泌乳月）。趙長友等（1998）綜述了纖維素酶在草食動(dòng)物日糧中的應(yīng)用，均取得了顯著效果。

雞日糧

肉雞日糧一般以高魚粉、高玉米、高豆粕為主。為減少這些常規(guī)原料的使用量，廣泛采用廉價(jià)的飼料原料，秦江帆等（1996）在肉雞日糧中提高富含纖維的麥麩比例，添加0、0.05%、0.1%纖維素酶制劑進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，添加0.1%纖維素酶組比對照組在1-2、3-6、7-8周三個(gè)生長階段日增重分別提高4.31%、4.54%、4.13%，耗料比分別下降1.56%、4.50%、4.3%。徐奇友（1998）在蛋雞日糧中添加0.1%、0.15%、0.5%纖維素酶，結(jié)果表明，在1-10月的產(chǎn)蛋期間，產(chǎn)蛋率分別提高0.53%、1.25%、2.88%，酶水平0.15%和0.5%組的破蛋率降低34.49%、16.19%，蛋殼強(qiáng)度分別提高14.71%和8.41%。

豬日糧

據(jù)尹清強(qiáng)等（1992）報(bào)道，在基礎(chǔ)日糧中添加0.6%和1.2%纖維素復(fù)合酶，結(jié)果生長育肥豬增重比對照組分別提高16.84%和21.86%。Wank等（1993）報(bào)道，添加纖維素酶，使中性洗滌纖維消化率由30.3%提高到34.1%，酸性洗滌纖維消化率從68.8%提高到73.9%，能量消化率由69.3%提高到71.8%。

纖維素酶產(chǎn)業(yè)開發(fā)展望

我國是一個(gè)飼料資源十分緊張的國家，土地少、人口多，人畜爭糧的矛盾十分突出。要保持我國飼料工業(yè)和畜牧業(yè)的持續(xù)發(fā)展，必須解決好飼料問題，否則將嚴(yán)重制約其發(fā)展。纖維素是自然界中十分豐富的資源，是800-1200個(gè)葡萄糖分子聚合而成。因此，可通過微生物發(fā)酵充分利用農(nóng)副產(chǎn)品下腳料、秸稈、糠生產(chǎn)纖維素酶添加劑，用于提高畜禽生產(chǎn)性能，提高飼料利用率，改善飼料的營養(yǎng)價(jià)值，降低飼料成本和提高經(jīng)濟(jì)效益，具有廣闊的開發(fā)前景，今后應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)纖維素酶研究和開發(fā)工作。主要有如下幾方面：

進(jìn)一步加強(qiáng)纖維素酶的作用機(jī)制研究

纖維素酶應(yīng)用于飼料，作用于動(dòng)物消化道，其機(jī)制尚未清楚。從理論上決定其添加量還很困難，受影響因素很多，往往效果不夠理想。對于單用多種原料的纖維素酶最佳添加量也研究不多，這將嚴(yán)重制約纖維素酶的推廣應(yīng)用。

酶的產(chǎn)量和活性都不高，成本偏高

今后應(yīng)加強(qiáng)菌種選育和發(fā)酵工藝等基礎(chǔ)研究工作，以提高其產(chǎn)量和活性，特別是要注意利用DNA基因重組技術(shù)的應(yīng)用，來選育出活性高、產(chǎn)酶量大的菌種。

加強(qiáng)纖維素酶檢測方法研究

雖然纖維素酶的檢測方法很多，但真正能適合飼料的檢測方法還沒有，這給實(shí)際應(yīng)用工作帶來困難，如無法比較不同廠家的產(chǎn)品質(zhì)量，確定纖維素酶添加量也很困難，應(yīng)組織有關(guān)力量，制訂出統(tǒng)一的檢測方法標(biāo)準(zhǔn)，供生產(chǎn)中應(yīng)用。

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