動物微生態制劑（益生菌）的標準、評價規程、功能
近些年，益生菌和消化道菌群的功能、作用效應和機制等方面的研究已經成為動物和人類醫學、營養學、飼料（食品）學、微生物學、免疫學和腸道健康科學等領域的研究熱點。同時，動物益生菌或微生態制劑產業迅速發展，也存在不少問題：①在菌株篩選方面，國內一些產品的基礎研究工作很差，對所用菌種的生物特性了解甚少，甚至連千分之一的菌株信息都不了解；②相當一部分產品功能不明顯，有的企業還過度夸大應用效果。實踐證明，沒有優良的菌種是其產品功效不明顯的最根本原因，這嚴重降低了該類產品的社會公信力，影響了該產業的持續健康發展；③乳酸菌類益生菌產品的穩定性直接影響貨架期和功效穩定性；④行業標準不健全，行業發展呈現“羊群效應”，結果呈現“羊放青”。為促進行業發展，本文重點闡述了發達國家益生菌的標準和評價規程及功能的新進展，并就我國益生菌的發展方向提出了作者的觀點。
1 外源益生菌進入動物消化道后，與胃腸道菌群再平衡后共同發揮作用
對于腸道菌群的全面認識有助于人們更好地管理和調控動物的腸道營養和健康。動物或人體在剛出生時，消化道內是無菌的，隨后，外界環境中的微生物隨著食物或飲水等逐漸進入消化道，并呈現從無到有、從少到多，其種類和數量逐漸增多，從劇增到緩增、此消彼漲，逐步進入穩定或平衡狀態，這個過程稱為菌群演替，并呈現多樣性和動態平衡。在單胃動物或人消化道寄居(棲息)著10倍于體細胞數、100倍于人體基因組的1014個細菌(Ley等，2006)，種類多達500~1500種。最近研究表明，人有1 150種(Park, 2009)，平均每個個體內約含有160種優勢菌種，并且這些菌群是絕大部分個體所共有的，這些種群構成了復雜的微生態系統(micro-ecosystem)，也有把這個系統稱為“微生物器官”(microbial organ) 和“免疫器官”，腸道微生物菌群也是人類目前了解最少的“器官”(Gershwin等，2004；O'Hara 等，2006；Smith 等，2010)。因此，動物或人被稱為“超級生物”。但每個個體都有自己獨特的菌群，就象每個有不同的指紋一樣。這些微生物與動物或人終生為伴，終生為益。可是在過去很長時間里，人們在動物養殖或飼料中大量使用抗生素來“消殺”腸道菌群，其實犯了一個嚴重的錯誤，不僅導致抗生素的濫用，也產生了多種負面效應（包括耐藥性、藥物殘留、生態環境等）。今后，應該充分認識胃腸道微生物的客觀存在和多種有益作用，采取“扶調”策略，合理管理和調控這些菌群，為動物的健康和飼料營養的消化利用發揮作用。
無論是單胃動物還是多胃動物，在其生長發育過程中，形成了固有的微生態系統，具有不同的優勢菌群，呈現生物多樣性。單胃動物(如豬禽和人等)的優勢菌群是擬桿菌屬（Bacteroides）、梭狀芽孢桿菌屬（Clostridium）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、優桿菌屬又稱真桿菌屬（Eubacterium）、乳酸桿菌屬（Lactoba cillus）、腸桿菌屬（Enterobacteriaceae）、鏈球菌屬（Streptococcus）、細梭菌屬（Fusobacterium）、消化鏈球菌屬（Peptostreptococcus）以及丙酸桿菌屬（Propioni bacterium）。多胃動物（如牛、羊等）的瘤胃是一個重要的微生態系統，其優勢菌群主要有可降解纖維的纖維桿菌屬（Fibrobacter）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、丁酸弧菌屬（Butyrivibrio）、擬桿菌屬（Bacteroides）以及普雷沃氏菌屬（Prevotella）、月形單胞菌屬（Sele nomonas）、鏈球菌屬（Streptococcus）、乳酸桿菌屬（Lac tobacillus）、巨球型菌屬（Megasphaera），一些厭氧真菌、纖毛蟲（原生動物）和產甲烷菌也出現在瘤胃中(Mackie等，2000)。此外，在通常情況下，動物腸道黏膜細胞中也寄生著大量病毒，從糞便排出的病毒有100 多個型別，每克糞便中可含100 多萬個病毒顆粒。在腸道還存在大量噬菌體，噬菌體(bacterio phage 或phage)是感染細菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒，噬菌體分布極廣，凡是有細菌的場所，就可能有相應噬菌體的存在。噬菌體是腸道菌群的“殺手”，也是影響消化道菌群平衡的重要內在力量之一。這些微生物菌群（細菌、真菌等）、病毒、噬菌體存在著復雜的生態關系和營養食物鏈網絡，它們彼此相互聯系、相互制約, 并與宿主細胞之間不斷地進行物質、信息、能量交流，其結構（組成）和比例影響著動物或人的健康。
消化道菌群通過其生物多樣性發揮多種生物學功能。消化道不同的微生物菌群，與飼料或食物消化、吸收及營養代謝(Koletzko 等、Lewis 等、Tannock，2005；張日俊等，2005、2006；Crozier 等，2006；Martin等，2007；Li 等，2008；Brandtzaeg 等，2009；Lee 等，2009；Floch 等，2010)、能量利用(Muramatsu 等，1994；Floch等，2010)、人或動物的免疫(Lewis等，2014；Tan⁃nock，2002；張日俊等，2005；Lee 等，2009)、健康和腸道疾病(Acheson 等，2004；Isolauri，2004；Pickard 等，2004；Stagg 等，2004；Svennerholm 等，2004；Verdu等，2004；Verdu等，2004)以及其它疾病如人類的肥胖病(Ley 等，2006；Musso 等，2010b、a；Tilg，2010；Flint，2011)、代謝綜合征（metabolic syndrome）(Tilg，2010)、糖尿病(Ley等，2006; Musso等，2010b)、生長發育有著密切關系(Hooper等，2001)，共生的腸道微生物調節人體的代謝表型(Li等，2008)，即腸道菌群影響人或動物的代謝活動和類型。
外源益生菌進入動物腸道后，與胃腸道菌群再平衡后共同發揮跨越腸道的多種作用。再平衡是指環境因素（益生菌、抗生素、益生元等給予或食物營養結構）變化引發腸道菌群的種類、結構和比例重新進行了微演替，并再次建立新環境下的新平衡。再平衡后的菌群（包含益生菌）通過不同器官的功能外延與不同生理系統間的物質、信息和能量交流及相互作用影響動物或人其它功能，包括病原的傳遞和感染、腫瘤的發生以及其口腔、肝臟、胃、呼吸系統、胰腺、中樞神經系統和骨質的健康，也影響到人的認知功能、肥胖和兒童成長等(Guarner等，2003；Charalampopoulos等，2009；Collado等，2009)，這些影響都遠遠超越了腸道范圍，跨越到動物或人體的多系統，從而產生廣泛和多方面的生物學作用。
2 從不同的益生菌(微生態制劑）概念認識其組成和特性
益生素(probiotics) ，國內也稱微生態制劑(micro bial ecological agents)，我國農業部官方稱微生物飼料添加劑，是Parker(1974) 提出的與“抗生素”相對的新概念，指從動物或自然界分離、鑒定的有益微生物, 經發酵培養和后加工（如干燥、包被、不同劑型制劑）等特殊工藝制成的有益活菌制劑。FAO/WHO以及EF SA(the European Food Safety Authority)等廣泛認可的定義是指當服用足夠數量時能對宿主產生健康有益的活微生物(Hill等，2014)。這個概念強調了“足夠數量”的活菌和促進健康作用。
筆者認為，如下的定義更能全面地反映目前市場所用益生菌的內涵。益生菌是含活菌和（或）死菌，包括其組分和產物的有益微生物制品，經口或經由其它黏膜途徑投入，旨在改善黏膜表面微生物或酶的平衡，或者刺激特異性或非特異性免疫機制(德國國際會議，1994)。這個概念首先強調了它的組成，即有益活菌+組分+代謝產物，或有益死菌+組分+代謝產物，或有益活菌+死菌+組分+代謝產物；其次強調了它的使用途徑（口服或黏膜給予）和作用（菌和酶的平衡、刺激特異和非特異性免疫）。因此，其越來越受到人們的關注，并廣泛應用于畜牧業、飼料工業和其它相關產業，它正帶動畜禽、水產、廄舍環境控制、糞污處理等領域的生產方式的根本性變革，國際上把它譽為“拯救地球的技術”，是飼料生物技術領域的重大革新技術。
3 益生菌選擇標準和評價規程
3.1 益生菌菌株選擇和制劑標準
建立益生菌選擇標準和評價規程對微生態產業的有序和規范化發展十分重要。我國至今少有建立益生菌的標準，更沒有建立評價規程。歐盟評價益生菌標準的規程見圖1。理想的益生菌應具備如下特性和安全標準(EFSA，2005)：①菌株沒有毒性和病原性；②菌株應有準確的分類鑒定；③目標菌株能在消化道棲息；④所選菌株能夠在消化道的目標位置存活、定植和產生代謝活性（如產生消化酶、有機酸等），能夠耐過胃液和膽汁、在胃腸道留存、粘附到腸上皮細胞或腸絨毛、能與常駐菌群競爭；⑤菌株能夠產生抗菌物質；⑥菌株能夠與病原菌拮抗；⑦菌株能夠調控免疫反應；⑧菌株具有遺傳穩定性；⑨益生菌制劑能發揮至少一種有確實科學依據支持的促進健康作用（減少毒胺、中和內毒素等）；⑩制劑在加工、貯藏和運輸過程中，菌株具有良好的可控性，其特性具有良好的穩定性；⑪制劑有良好的活性，包括菌株活性、代謝產物活性；⑫制劑在工業加工過程中，具有理想的風味和工藝特性。
相比之下，我國在益生菌篩選方面，相對粗糙和差距較大，特別是在上述①、④、⑧、⑨、⑫項目上缺乏科學扎實的研究。
3.2 歐盟和FAO/WHO的益生菌評價規程
歐洲聯合會基金項目“人用益生乳酸菌的生物安全評價”(PROSAFE)的目標是提出基于安全性評估證據基礎上的人用益生菌的推薦規范。這個項目的結論在2006年一次研討會上提出建議：①分子的方法,如核糖體DNA測序，在非常權威和專業的實驗室進行，進行準確的分類。此外，益生菌菌株應存入公共菌種保藏中心。②對抗生素有抗性的非野生型（或人工改造）微生物未經過恰當的風險評估，不應該作為未來人或動物的產品開發。③應避免使用腸球菌（如糞腸球菌等）或其它有毒性基因的乳酸菌。其他特性,包括膽汁酸脫抱合作用、黏附細胞作用和與毒性無關的細胞外基質蛋白以及益生菌在體外結腸的模型中存活都認為與生物安全評估無關。④除了體內安全評估準則外，通過隨機的、安慰劑對照和雙盲設計研究在人類的定植情況，但這樣研究的細節并不是特定的。⑤運用動物模型來測定安全性是很有爭議的。然而,實驗性心內膜炎大鼠模型被認為是最可靠的動物模型。
FAO/WHO 在2002也建立了一套與歐共體類似的安全性評估指導規則。要點如下：①建立傳統產品的安全使用歷史；②不能存在抗生素耐藥性轉移的風險；③不能出現毒性風險；④要評估某種特定的代謝活性，如D-乳酸鹽生產、膽汁鹽脫抱合；⑤如果某菌株是一種已知的哺乳動物毒素生產者，需要測試毒素生產情況和安全性；⑥如果某菌株是具有已知的溶血潛能，就應測定其溶血活性；⑦評估產品有無副作用；⑧產品銷售市場后，對消費者使用后出現的各種不良事件，應進行流行病學監測。
3.3 理想的益生菌菌株選育應遵從特異性和多樣性原則
產品開發者和使用者都要注意菌株的特異性，即同名的不同菌株的生物學特性會有較大差異性，而且其所發揮的作用或功效也是不同的，具有株、種、屬的特異性（差異性）。這種差別表現在多方面，如生長快慢、抗逆性（抗酸、堿、膽鹽、熱等）、產酸特性、死亡菌體對大腸桿菌或沙門氏桿菌等病原菌的抗黏附性、產酶特性（動物和微生物都可以產生的消化酶如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等，只有某些（不是所有）微生物能產生非淀粉多糖酶、纖維素酶等）、是否產生抗菌物質、是否對生產性能（如飼料轉化效率、肉蛋奶產量等）有正效應、是否具有免疫刺激特性以及加工和儲運特性等。對有條件的企業，還應該對所選的優秀菌株進行全基因組測序，通過功能基因組學進一步了解所選菌株的生物學特性，作者課題組2014年完成了益生芽孢桿菌LFB112的全基因組測序，這也是我國第一株測序的益生芽孢桿菌，在GenBank中的登錄為CP006952，從基因組信息獲知該菌的185個代謝途徑產生7種抗菌物質以及產生多種酶、有機酸、維生素、調節免疫等多種信息。希望生產企業深入篩選菌種，使用者認真選擇產品。
我國目前市場上許多益生菌產品中所用菌株的特異性和多樣性不明顯。農業部2013年公布了我國允許添加的微生物種類有34種，但在各類益生菌產品中實際所用的菌種最多的是枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、糞腸球菌、屎腸球菌、植物乳桿菌、釀酒酵母，其次是嗜酸乳桿菌、產朊假絲酵母、乳酸片球菌、戊糖片球菌、凝結芽孢桿菌、側孢短芽孢桿菌、丁酸梭菌，目前還沒有一種產品含有雙歧桿菌。長期過度、過多、過集中地使用某幾種益生菌有可能導致使用效果（功效）降低，而且破壞大生態的微生物平衡。自然生態界遵循多樣性原則，即多樣性越豐富，生態環境越穩定、越健康。因此，呼吁開發和生產益生菌的企業應盡量增加益生菌的多樣性。
4 益生菌（微生態制劑）的生物學功能
益生菌或微生態制劑的功能可以簡單概括為三大方面，即生理機能調節功能、健康保護功能和營養調控功能。益生菌能否產生明顯的正效應取決于益生菌在腸道內是否自身能形成優勢菌群或通過其調控作用形成另外一種或幾種內源性有益優勢菌群。必須指出的是，如下所述的益生菌作用也不是所有的益生菌都能具有的，是益生菌的菌株特異性所致。
4.1 益生菌對宿主生理機能的調節
優秀的益生菌進入消化道后，其自身或通過調控內源有益菌形成優勢菌群，對動物機體的生理功能產生重要影響。①促進幼齡動物消化道的發育和成熟（如腔室體積增加、消化道壁結構復雜化）或促進生長動物腸道絨毛的密度和長度增加；②降低消化道內容物的pH值、氧化還原電位和改變其化學成分等；③對消化道腸蠕動、上皮細胞再生的影響；④菌群消耗營養產生的代謝產物影響動物體代謝途徑；⑤某些益生菌還可降低動物的應激反應，如熱應激引起的蛋雞產蛋量下降；⑥有些益生菌還能與共生菌協同降低有害菌導致的緩慢亞臨床炎性反應。
4.2 益生菌對宿主健康的保護功能
益生菌的健康保護作用表現在4大屏障作用方面(Salminen 等，1996；Gionchetti 等，2005；Isolauri 等，2005；Luyer等，2005；Penna等，2008；Resta-Lenert等，2009)。
4.2.1 機械屏障
機械屏障是由腸道黏膜上皮細胞，上皮細胞間緊密連接，以及腸表面黏液等構成，能有效阻止細菌穿透黏膜進入深部。益生菌有利于加強腸道上皮細胞間的緊密連接，促進杯狀細胞黏液的分泌及抑制腸上皮細胞的凋亡，進而維持胃腸道黏膜組織的完整性，抵制致病菌對腸黏膜的破壞。
4.2.2 生物屏障
腸腔表層稱為腔菌群，主要為大腸桿菌、梭狀芽孢桿菌等；深層的為膜菌群，主要是具有黏附特性的雙歧桿菌和乳酸桿菌。益生菌或膜菌群通過占位保護產生細菌素、有機酸、過氧化氫等物質來阻止或抑制致病菌和條件致病菌侵襲黏膜。
4.2.3 免疫屏障
腸道是天然免疫和獲得性免疫的重要場所，能夠保護腸道免受外來的抗原破壞和免遭異常的免疫應答反應，它主要由腸道相關淋巴組織（派伊爾氏結、腸系膜淋巴結等）、細胞（腸上皮細胞、抗原遞呈細胞、T細胞、B 細胞等）和分子（防御素、細胞因子、免疫球蛋白等）構成。研究表明，腸道菌群或益生菌可通過改善腸上皮細胞免疫功能以及腸道抗原遞呈細胞、淋巴細胞（T細胞、B細胞）等的功能來調節機體的免疫功能。
4.2.4 化學屏障
由消化道分泌的胃酸、溶菌酶、細菌素、黏多糖和蛋白分解酶以及膽汁等構成了腸道化學屏障，具有一定的殺菌和溶菌作用。益生菌或內源微生物通常能產生有機酸，有的益生菌還能產生細菌素、過氧化氫等發揮化學屏障作用。
4.3 益生菌對宿主的營養調控作用
營養調控作用是指益生菌在消化道內發揮了一系列類似營養素的作用，即通過益生菌產生的消化酶（如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、非淀粉多糖酶、纖維素酶等）、代謝產酸（乳酸、醋酸、丙酸、丁酸等）、維生素、氨基酸等發揮一系列營養調控作用。但發揮這些作用是以大量益生菌和腸道內源微生物消耗能量物質為代價的。如果益生菌消化了一定量的營養而沒有產生更多的有益作用，這種益生菌產品則表現出的功效不明顯或負效應。大量研究表明，益生菌和內源菌在腸道代謝產生的短鏈脂肪酸（SCFA）可在盲腸和結腸通過被動擴散吸收，然后穿過上皮進入不同的組織或器官代謝，如乙酸在肌肉、脾、心臟、腦內代謝，丙酸參與肝臟的吸收和代謝和糖異生作用，丁酸在結腸上皮代謝，維持正常細胞分化，結腸上皮細胞能量的60%~70%來自細菌發酵。雙歧桿菌可產生磷蛋白磷酸酶，可增加蛋白質的吸收、利用和貯留，還通過抑制腐敗菌來減少養分的消耗；有些微生物能利用氨態氮，提高氮利用，并可減少氨氣、生物胺、硫化氫等的形成，改善畜舍環境，減少排泄物中氮、磷的排放。雙歧桿菌能合成VB1、VB6、VB9、VB12；嗜熱鏈球菌、保加利亞乳酸乳桿菌產葉酸，后者還產生VB2、VB6(張日俊, 2003b)。
4.4 其它功能：跨越腸道影響宿主肝、胰、神經等功能
外源益生菌或內源菌群通過腸道上皮細胞、彌散的淋巴組織、神經細胞（如腦腸軸）等與宿主的不同生理器官或組織進行物質、信息和能量交流及相互作用，進而影響宿主的其它功能，如腸道病原的傳遞和感染、腫瘤的發生以及其口腔、肝臟、胃、呼吸系統、胰腺、中樞神經系統和骨質的健康，也影響到人類的認知功能、肥胖和兒童成長等(Guarner等，2003；Chara lampopoulos等，2009；Collado等，2009)，這些影響都遠遠超越了腸道范圍，跨越到宿主的多種器官和組織。
5 益生菌發展趨勢
在益生菌或動物微生態研究領域，運用分子生物學、悉生動物學、元（宏）基因組學、益生菌基因組學、代謝組學、轉錄組學、蛋白質組學、微生物發酵工程等領域的先進技術和方法，深入研究消化道微生物或益生菌與宿主營養代謝、免疫、生長發育、健康、疾病以及產品品質之間的相互關系和作用機理，特別是通過腸道宏基因組，發現有價值的微生物功能基因，并加以挖掘、開發和利用，這是未來基礎理論研究的熱點和重點。另外，益生菌（微生態制劑）、益生元（或合生元）在抗感染（生物防治）、營養與免疫調控、抗生素替代、恢復生態、健康養殖和食品安全中發揮重要的作用，必將成為未來應用研究的熱點。
在益生菌或動物微生態產業方面，有“四駕馬車”，一是與健康養殖業結合，開發飼養環境控制和減排的微生態制劑；二是與飼料工業結合，開發低成本的、適于飼料添加的飼用抗生素替代品、飼料消化改善劑，并加強益生菌培養物和生物飼料專用制劑的開發；三是與動物保健業結合，開發動物生防制劑、發酵中草藥、免疫調節劑、生物獸藥（如細菌素）以及傳遞特異性病原性抗原基因的益生菌，當然后者目前受到國家政策的限制；四與動物環保產業結合，開發動物糞便污水處理制劑。
就市場而言，據美國Transparency市場研究機構的調研，到2018年益生素和益生元的全球市場達到$44.9 billian（449億美元，約即2 700億人民幣）。益生菌是生物飼料（俗稱發酵飼料）的核心技術之一，生物飼料是21世紀飼料工業的最后一桶“黃金”，據估計，再經過3~5年的發展，生物飼料可占到飼料總產量的15%~20%，其產量可能達到0.4~0.6億噸。但市場競爭也愈加激烈，市場競爭的核心是技術，正確的選擇是產學研合作，希望微生態科學和產業的明天會更美好。
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