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導讀

益生菌是一種能夠抑制有害菌生長繁殖，改善腸道菌群平衡，促進營養物質消化吸收，提高宿主健康水平及飼料轉化率，無毒、無害、無殘留、安全、無副作用的微生物添加劑。益生菌大體上可以分為三大類: 乳桿菌屬、雙歧桿菌屬及部分革蘭氏陽性球菌，另外還包括明串球菌屬、丙酸桿菌屬、芽孢桿菌屬及部分益生真菌。益生菌作為飼料添加劑對動物的促生長作用已被廣泛認可，但也存在著很多問題，如適宜作為益生菌的菌種數量仍較少; 活菌制劑進入動物腸道后易受鹽酸、膽汁酸等影響，難以發揮較好的作用; 活菌制劑在加工、運輸和貯存中易失去活性，使用效果降低等。其中，益生菌制劑活菌數量是其產品質量和活性檢測的重要指標之一，但極易受到吸附載體、溫度、制劑類型及貯存條件的影響，從而影響產品的穩定性和使用效果。有報道顯示，在40 ℃恒溫條件下貯存3個月，益生菌活菌數量可急劇下降5 個數量級; 室溫條件下貯存24 個月，活菌數量下降不超過2 個數量級; 低溫(0～4 ℃) 條件下存貯，活菌數量基本保持穩定。如何制備穩定的菌劑，使其能夠長期貯存并保持其活菌數量，是目前益生菌制劑產業亟需解決的問題之一。

短短芽胞桿菌(Brevibacillus brevis)是一種革蘭氏陽性細菌，其細胞壁結構簡單，蛋白分泌能力強，不含內毒素，在臨床和環境應用方面安全，目前在生物防制、微生物保鮮及微生物降解等方面應用廣泛，但關于其在益生菌方面的研究鮮見報道。Che 等研究發現，短短芽胞桿菌FJAT-1501-BPA 首次被發現可以降低斷奶仔豬的料重比、腸道大腸桿菌和沙門氏菌數量，提高乳酸菌含量。但目前對利用該菌株制備益生菌劑的研究還未開展，為獲得短短芽胞桿菌FJAT-1501-BPA 益生菌制劑的最佳制備方法，本研究探索了穩定劑、防腐劑、鹽濃度和pH 對短短芽胞桿菌FJAT-1501-BPA制劑保存特性的影響、貯存過程中活菌數及抑菌能力變化，同時開展了該菌株芽孢產率及耐熱性、抗生素敏感、抑菌及胃腸道環境耐受力的評估，旨在為擴大其應用提供科學依據。

1.1 材料

11.1 供試菌

株短短芽胞桿菌FJAT-1501-BPA由本實驗室篩選鑒定; 靶標菌株: 金黃色葡萄球菌( Staphylococcus aureus) 、大腸桿菌( Escherichia coli)及沙門氏菌( Salmonella) 均由福建省疾病預防控制中心提供。

1.1.2 培養基

發酵培養基: 豆餅粉3%、蔗糖2%、可溶性淀粉0.8%、CaCl20.5%、蛋白胨0.2%，pH7.0～7.2，由實驗室自行配制。

1.1.3 溶液配制

人工胃液: 在約800 mL 水中加入稀鹽酸16.4 mL，加入10 g 胃蛋白酶( 10 000 NFU/mg) 搖勻，加水稀釋成1 000 mL，調pH 至3.0，用0.22 μm 無菌過濾器過濾除菌待用; 人工腸液: 磷酸二氫鉀6.8 g，加500 mL 水溶解，用0.1 mol /L 氫氧化鈉溶液調pH 至6.8，另取胰蛋白酶( 250 NFU/mg) 1g，加適量水溶解，兩液混勻后，加水稀釋至1 000 mL，0.22 μm 無菌過濾器過濾除菌待用。

1.2 方法

1.2.1 不同穩定劑對短短芽胞桿菌FJAT-1501-BPA

貯存的影響將黃原膠、瓊脂、海藻酸鈉、海藻酸鉀、海藻酸銨、卡拉膠、羧甲基纖維素鈉、海藻酸丙二醇酯8 種穩定劑( 終濃度為2.0‰) 分別與發酵液混合，室溫放置3 d 后，觀察制劑外觀形態并測定穩定性。將初篩得到的穩定劑進行復篩，使其終濃度為0.5‰、1.0‰、1.5‰、2.0‰，室溫放置3 d 后，觀察制劑外觀形態并測定穩定性。

1.2.2 不同NaCl 濃度對短短芽胞桿菌FJAT-1501-BPA保存特性的影響

分別取100 mL 發酵液于150 mL 三角瓶中，添加0、2%、4%、6%、8%和10%NaCl，以不加NaCl 為對照。分別在0、5、10、15、20、25、30 d 取樣，稀釋后涂布于NA 平板，重復3 次，30℃培養48 h，統計活菌數，計算存活率及雜菌率。存活率( %) = Nt/N0×100%，式中，Nt，貯存不同時間的活菌數; N0，0 d 的活菌數; 雜菌率( %) = 雜菌數/( 短短芽胞桿菌數+雜菌數) ×100%。

1.2.3 不同pH 對短短芽胞桿菌FJAT-1501-BPA 保存特性的影響

分別取100 mL 發酵液于150 mL的三角瓶中，在pH 分別為1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 和11.0 下常溫保存，分別在0、5、10、15、20、25、30 d 取樣，稀釋后涂布于NA 平板，重復3 次，30 ℃ 培養48 h，統計活菌數，計算存活率及雜菌率。

1.2.4 不同防腐劑對短短芽胞桿菌FJAT-1501-BPA保存特性的影響

分別取100 mL 發酵液于150mL 的三角瓶中，分別添加終濃度為0.1‰的雙乙酸鈉、苯甲酸、苯甲酸鈉、丙酸銨、山梨酸、山梨酸鉀、山梨酸鈉、檸檬酸、檸檬酸鉀、檸檬酸鈉、檸檬酸鈣11種防腐劑，對照組不添加任何防腐劑，常溫保存，分別在0、5、10、15、20、25、30 d 取樣，稀釋后涂布于NA 平板，重復3 次， 30 ℃培養48 h，統計活菌數，計算存活率及雜菌率。

1.2.5 長期貯存過程中膠懸劑活菌數及抑菌能力的變化

取200 mL 發酵液于250 mL 藍口瓶中，添加0.1‰檸檬酸鈣、2‰黃原膠，并分別添加0、3%、6%、9%、12%、15%NaCl，調節pH 為7.0，常溫保存，分別于0、10、30、60、90、120、150、180、210、240、270、300 d 取樣。稀釋后涂布于NA 平板，重復3次， 30 ℃培養48 h，統計活菌數。同時，取10、60、120、180、300 d 進行抑菌效果檢測。

1.2.6 短短芽胞桿菌FJAT-1501-BPA 的體外益生效果

1.2.6.1 菌懸液制備

將菌株活化2 次后接種于NA 液體培養基中，30 ℃、170 r /min 下振蕩培養48 h，置于80 ℃水浴15 min，7 000 g 離心10 min，收集菌體; 采用PBS 緩沖液洗滌2 次，并用PBS 緩沖液懸浮即為菌懸液。

1.2.6.2 產芽孢率及耐熱性

將菌株活化2 次后接種于NA 液體培養基中，30 ℃、170 r /min 振蕩培養，分別在24、48、72 h 取樣，測定產芽孢率; 取菌懸液1 mL，加入到9 mL PBS 溶液中，充分混勻后，100℃加熱0、2、5、10、15、20、30 min 后，以無菌生理鹽水按1 ∶ 10 梯度稀釋，進行平板菌落計數并計算存活率。

1.2.6.3 人工胃腸液及膽鹽耐受性

取菌懸液1mL 加入到9 mL 人工胃液及人工腸液中，充分混勻后， 37 ℃、170 r /min 振蕩培養3 h，分別于0、3 h 取樣，以無菌生理鹽水按1 ∶ 10 梯度稀釋，進行平板菌落計數并計算存活率。在LB 液體培養基中加入0.3%( W/V) 的豬膽鹽，121 ℃滅菌20 min。取1 mL菌懸液于培養基中，37 ℃、170 r /min 振蕩培養24 h，分別于0、24 h 取樣，將無菌生理鹽水按1 ∶ 10 梯度稀釋，進行平板菌落計數并計算存活率。

1.2.6.4 抑菌作用及抗生素敏感性

將100 mL09% NA 培養基熔化并冷卻到50 ℃后，加入100 μL菌濃度為1×107CFU/mL 指示菌株發酵液，渦旋震蕩后傾覆在預先已凝固的NA 下層培養基上。靜置數分鐘后，在雙層培養基平板上打孔，分別向每個孔內加入無菌水及發酵上清液各100 μL，以無菌水為空白對照， 37 ℃培養24 h，重復3 次，觀察菌株生長情況并測量抑菌圈直徑。

1.2.6.5 抗生素敏感試驗

將含有定量抗生素的濾紙片( 頭孢唑林30 μg /片、氨芐西林10 μg /片、慶大霉素10 μg /片、紅霉素15 μg /片、氯霉素30 μg /片、鏈霉素10 μg /片、四環素30 μg /片、利福平5 μg /片、新霉素30 μg /片、多黏菌素B 30 μg /片)貼在已接種了短短芽胞桿菌FJAT-1501-BPA 的NA培養基上， 30 ℃培養24 h，重復3 次，觀察生長情況并測量抑菌圈直徑。

1.3 數據分析

所有數據采用Microsoft Excel 2010 和SPSS 17.0 進行統計分析，One-Way ANOVA 進行單因素方法分析，Duncan 氏法進行多重比較，結果用平均值±標準差表示，以P＜0.05 作為差異顯著性判斷標準。

2結果

2.1 短短芽胞桿菌FJAT-1501-BPA 膠懸劑的制備

2.1.1 穩定劑對短短芽胞桿菌FJAT-1501-BPA 膠懸劑的影響

由圖1 可知，將2.0‰穩定劑與發酵液混合，室溫放置3 d 后發現，黃原膠與瓊脂膠懸效果最好，無上下分層，穩定性良好。對黃原膠和瓊脂進行復篩發現，1.0‰、1.5‰、2.0‰黃原膠質地均勻，無上下分層，穩定性良好，其中2‰黃原膠沉淀率最高為26.89%，穩定性最好; 0.5‰、1.0‰、1.5‰、2.0‰瓊脂均出現結塊分層現象( 圖2) 。因此，選用2.0‰黃原膠為穩定劑以保證膠懸劑的穩定性。

2.1.2 NaCl 濃度對短短芽胞桿菌FJAT-1501-BPA膠懸劑的影響

由圖3 可知，隨著保存時間的延長，活菌數呈遞減的趨勢。當發酵液NaCl 濃度為4%時，短短芽胞桿菌FJAT-1501-BPA 初始活菌數為2.43×107CFU/mL，保存5、10、15、20、25、30 d 時，活菌數顯著下降( P＜0.05) ，分別為44．31%、55．14%、39.64%、28.26%、16.05%、22.63%，30 d 時活菌數量高于其他NaCl 濃度且無雜菌?？紤]到發酵液存放期間盡可能保持活菌數和減少雜菌率，選擇4%NaCl 進行長期存放。

2.1.3 pH對短短芽胞桿菌FJAT-1501-BPA 膠懸劑的影響

由圖4 可知，當pH 調至1.0 時，在保存30 d 后，活菌數顯著下降為0.53 × 107CFU/mL( P＜0.05) ，但存活率仍為15．01%，說明短短芽胞桿菌FJA-1501-BPA 在強酸條件也能生存; 將發酵液pH調至3.0 時，活菌數較多，當發酵液pH 調至5.0、7.0、9.0、11.0 處理30 d 后，活菌數分別為2.53×107、1.00×107、0.57×107、1.77×107CFU/mL; 當pH 調至7.0時，貯存10 d 時，其活菌數最多，顯著高于貯存0、5、15、20、25 和30 d( P＜0.05) ，綜合考慮細胞滲透壓平衡和貯存時間，最終選擇將發酵液pH 調至7.0 時進行長期存放，盡可能保持活菌數和減少雜菌率。

2.1.4 防腐劑對短短芽胞桿菌FJAT-1501-BPA 膠懸劑的影響

由表1 可知，在處理30 d 后，不同防腐劑處理組的活菌數略有不同，但活菌數均在1×106CFU/mL 以上且無污染雜菌。這可能是短短芽胞桿菌FJAT-1501-BPA 自身產生的抑菌物質對其控制雜菌污染產生作用。因此，選擇0.1‰雙乙酸鈉、0.1‰山梨酸鉀、0.1‰檸檬酸鈣添加于發酵液中，進行長期保存。

2.2 長期貯存過程中短短芽胞桿菌FJAT-1501-BPA 活菌數及抑菌能力變化

2.2.1 活菌數

隨著保存時間的延長，活菌數略有增加，其結果見表2。由表2 可知，初始第0 天，鹽濃度為0、3%、6%、9%、12%、15%時的活菌數分別為8.08、8.10、8.10、8.08、8.07、8.08 log( CFU/mL) ; 保存300 d后，活菌數分別為8.76、8.62、8.70、8.67、8.46、8.52 log( CFU/mL) 。同一濃度保存不同時間，活菌數顯著升高( P＜0.05) ，但總體來說，添加一定量的NaCl 有利于短短芽胞桿菌FJAT-1501-BPA的長期貯存。

2.2.2 抑菌能力

由表3 ～ 5 可知，同一NaCl 濃度下，隨著貯存時間的延長，該菌株對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的抑菌活性有所降低，但不同的鹽濃度對長期貯存后的抑菌活性影響不大，因而制備菌劑時，選擇4% NaCl 進行貯藏。

2.3 短短芽胞桿菌膠懸劑益生特性評價

2.3.1 發酵水平

由表6 可知，短短芽胞桿菌FJAT-1501-BPA 在發酵72 h 時，孢子數顯著高于發酵24 及48 h( P＜0.05) ，發酵24、48 及72 h 產孢率分別是0.87%、7.58%、60.82%，說明該菌株具有良好的產芽孢能力。

2.3.2 耐熱性

由表7 可知，在100 ℃加熱0、2、5、10、15、20、30 min 后，菌株耐熱率分別為100.00%、36.41%、12.66%、1.97%，加熱15、20、30min 后，菌株耐熱率均＜1%，加熱30 min 后活菌數仍達到3.06 log( CFU/mL) ，說明該菌株具有一定的耐熱性。

2.3.3 人工胃腸液和豬膽鹽耐受性

由表8 可知，短短芽胞桿菌FJAT-1501-BPA 在人工胃液中保持3 h 后存活率為23.16%，活菌數量有一定的降低，說明其對人工胃液中具有一定的耐受性; 在人工腸液中作用3 h 后，其存活率達到48.62%，說明該菌株對人工腸液具有良好的耐受性; 該菌株在豬膽鹽環境中耐受性最好，在0.3%( W/V) 的豬膽鹽環境中培養24 h 后，菌株生長良好，存活率達到98.83%。

2.3.4 抑菌譜

由圖5 可知，該菌株對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌的抑菌圈直徑分別為21.42、21.33、15.83 mm，說明，該菌株對動物病原菌具有較好地抑制作用。

2.3.5 抗生素敏感性

由圖6 可知，短短芽胞桿菌FJAT-1501-BPA 對紅霉素、頭孢唑林和慶大霉素極度敏感，其抑菌圈大小均達20 mm，對新霉素、利福平、氯霉素、四環素和多黏菌素B 高度敏感，抑菌圈直徑為15～20 mm; 對鏈霉素中度敏感，抑菌圈直徑為10.1～15.0 mm; 對氨芐西林為耐藥。

3討論

延長益生菌制劑的保質期，控制雜菌率有多種方法，如控制溫度、pH、鹽度及添加防腐劑等。菌活力強、活菌數量大，才能有效維持胃腸道微生物生態環境平衡，發揮最大的益生作用。郭照輝在進行畜禽用凝結芽孢桿菌( Bacillus coagulan) 液體菌劑雜菌控制及保存期初步研究時，在凝結芽孢桿菌發酵液中添加0.5%苯甲酸鈉，調節發酵液pH 為4.0，置陰涼干燥處常溫保存270 d 發現，菌株存活率為40.06%，凝結芽孢桿菌是一種同型乳酸發酵的綠色微生物飼料添加劑，在酸性條件下( pH 4.0) ，凝結芽孢桿菌孢子對熱幾乎沒有耐受性，而且生長受到抑制。而短短芽胞桿菌FJAT-1501-BPA 在pH 3.0 ～ 15.0 時均能生長，其生長的pH 范圍比目前報道的益生菌菌株更廣，因而可能更適合作為益生菌菌株進行應用。此外，本研究選擇使用0.1‰檸檬酸鈣、0.1‰山梨酸鉀、0.1‰雙乙酸鈉3 種防腐劑組合并且添加4% NaCl，為增強產品的穩定劑還添加了2.0‰黃原膠，常溫保存300 d 時，菌株存活率為100%，明顯優于郭照輝研究結果。因此，本研究提供了一種益生菌液體制劑保存的新方法，可以延長菌劑的貯藏時間，便于運輸。

芽孢桿菌作為益生菌飼料添加劑的核心組成成分，其自身益生效果的優劣是決定后期發酵產品最終應用效果的關鍵因素。產芽孢率高、耐熱性強且能在工業化發酵生產后保持一定數量的活菌是作為益生菌條件之一。王巧麗等研究發現，豬源益生羅伊氏乳桿菌在70 ℃水浴培養2 min 時菌株基本死亡，而高書鋒等研究發現，凝結芽孢桿菌W-02 益生菌在80 ℃水浴30 min，活菌數為1×105～1×106CFU/mL。本試驗結果發現，短短芽胞桿菌FJAT-1501-BPA 在100 ℃ 水浴加熱30 min，活菌數仍為3.06 log( CFU/mL) ，由此可知，短短芽胞桿菌FJAT-1501-BPA 耐熱性優于乳酸桿菌，可以保證其發酵后存活足夠數量的菌體。胃酸和膽汁具有抗菌作用，益生菌只有能夠抵御低pH 和高膽汁鹽時才能在腸道內存活并正常發揮生理作用。短短芽胞桿菌FJAT-1501-BPA 在人工胃液、腸液、0.3%豬膽鹽培養3、3、24 h 后菌株存活率分別為23.16%、48.62%、98.83%，其在人工胃腸液中存活率雖較低但不致死。閔鐘熳等發現，芽孢桿菌B5329、B22、B544，在人工胃液中處理4 h，存活率分別為12.02%、7.94%、6.03%，在人工腸液、0.3%豬膽鹽中存活率維持在較高的水平。本試驗中短短芽胞桿菌FJAT-1501-BPA 與上述3 株芽胞桿菌一樣具有耐胃腸液及膽鹽能力，能夠在腸道內存活。維持腸道微生態平衡是益生菌的作用之一，故益生菌菌株要具備抑制病原菌的特性。短短芽胞桿菌FJAT-1501-BPA 對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的抑菌圈直徑分別為21.42、21.33、15.83mm，與李善仁等的研究結果一致，其發現3 株芽孢桿菌作為益生菌對腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的平均抑菌圈直徑分別為15.56、15.50、23.55mm。以目前畜牧養殖現狀來看，不同動物的不同生長階段還需要添加一定量的抗生素，所以需要考慮抗生素與益生菌是否存在協同作用。短短芽胞桿菌FJAT-1501-BPA 對鏈霉素、氨芐西林不敏感; 而對紅霉素、頭孢唑啉、慶大霉素、新霉素、利福平、氯霉素、四環素和多黏菌素B 均較敏感。李雅麗等發現6 株芽孢桿菌對鏈霉素、氨芐西林等10 種常用飼用抗生素均較敏感，建議避免與抗生素同時使用。短短芽胞桿菌FJAT-1501-BPA 可能攜帶了鏈霉素、氨芐西林耐藥性基因，該菌株與此類抗生素可以在飼料中同時添加，互不影響。

4結論

添加4%NaCl、0.1‰檸檬酸鈣、0.1‰山梨酸鉀、0.1‰雙乙酸鈉、2.0‰黃原膠，調節pH 為7，可獲得長期保存的短短芽胞桿菌FJAT-1501-BPA 膠懸劑配方，有望為益生菌液體制劑的制備提供新的方法。短短芽胞桿菌FJAT-1501-BPA 對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌3 種腸道病原菌具有抑制作用，具有產孢率高、耐熱性強、耐酸、耐膽鹽的特性，可與鏈霉素、氨芐西林同時使用，具備了優良益生菌的條件。