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導讀

    抗生素在畜牧生產中的濫用，導致抗藥、耐藥、殘留及超級病菌的產生，已引起了世界各國的普遍關注。許多國家已經禁止抗生素作為飼料添加劑，尋找一種綠色環保型抗生素替代品———微生態制劑也就應運而生。益生菌是一種微生物補充劑，通過改善宿主腸道微生物菌群平衡，對宿主產生有益的效果。益生菌之所以對人和動物體的健康有益，與其生物學特性緊密相關，可幫助宿主提高營養物質的消化利用率。益生菌能黏附在人和動物腸道黏膜上生長繁殖，是其產生有益作用的前提之一。當益生菌在腸道內定植并大量繁殖后，可競爭性地與病原微生物爭奪營養物質，并產生相應的細菌素等生物活性物質，來抑制病原微生物的生長和繁殖，從而提高機體的健康水平。譬如乳酸菌產生的乳酸等有機酸能降低腸道pH值，在動物處于應激狀態時亦能維持腸道內環境的穩定，防止病原菌因勢而起；還有一些益生菌能產生抗菌肽，從而抑制有害菌的生長。益生菌能刺激腸道黏膜，產生黏膜免疫應答，增強體液和細胞免疫，促進抗炎因子的產生，減少炎癥反應。研究表明乳酸菌能激活巨噬細胞，增強對致病菌的殺滅作用，提高黏膜免疫相關因子的表達水平，從而提高機體免疫力。

    仔豬由于胃腸道發育不健全，同時在其生長過程還伴隨著斷奶、飼料變化、轉舍等應激因素，將會導致仔豬腸道菌群紊亂，易引發疾病，致使仔豬成活率低。目前，益生菌廣泛應用于我國養豬業生產中。研究發現，在哺乳仔豬的教槽料中添加復合益生菌，可提高仔豬日增重，降低仔豬腹瀉率和死亡率，并降低仔豬生長前期糞便中大腸桿菌數量及提高乳酸菌數量，對改善腸道健康具有重要意義。另據報道，利用嗜酸乳桿菌和枯草芽孢桿菌灌服哺乳仔豬，發現益生菌能顯著提高仔豬日增重、血清免疫球蛋白含量及腸道乳酸桿菌數量，降低仔豬腹瀉率和糞便中大腸桿菌數量，并對小腸絨毛的發育有促進作用。由于不同的益生菌及其組合具有不同的益生功能，研究和開發新的復合益生菌對仔豬的健康生產具有重要意義。

    本研究根據益生菌對病原菌生長和繁殖的抑制作用，制成干酪乳桿菌和糞腸球菌的復合液體制劑，以哺乳仔豬為試驗對象，探索益生菌對乳仔豬生長性能和健康狀況的影響，為哺乳仔豬健康生長提供良好的理論和實踐指導。

1.1 菌種選擇

     試驗選用干酪乳桿菌（Lactobacillus Casei）和糞腸球菌（Enterococcus faecalis）菌種均購自中國科學院微生物研究所，并由河南農業大學動物營養與生物技術研究室保存。根據本研究室前期的工作基礎，確定干酪乳桿菌和糞腸球菌的比例為3∶1時，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌生長的抑制能力最強，并以此配比進行下一步的哺乳仔豬試驗。

1.2 培養基及培養方法

     培養干酪乳桿菌和糞腸球菌的乳酸細菌培養基（MRS）組成：胰蛋白胨15ｇ、酵母浸粉1ｇ、葡萄糖20ｇ、吐溫－80 1mL、磷酸氫二鉀2ｇ、乙酸鈉5ｇ、檸檬酸銨2ｇ、硫酸鎂0.2ｇ、硫酸錳0.05ｇ，用蒸餾水定容至1L，在MRS液態培養基中加入1.5％瓊脂可制備MRS固態培養基，2種培養基在121℃、0.15MPa高壓蒸汽滅菌20min備用。干酪乳桿菌和糞腸球菌37℃靜置培養24ｈ，測定培養液的活菌數，分裝并于4℃保存備用，使用前調整2種菌活菌數為1×10⁹ CFU／mL。糞便中乳酸菌數量的測定采用厭氧管滾管培養法，在37℃下靜置培養48ｈ。微生物數量的表示方法，以每1mL或1ｇ樣品中所含的菌落數（CFU）為標準，以自然對數值（Lｇ）表示。

    培養大腸桿菌的伊紅美藍鑒別培養基（EMB，北京奧博星）組成：稱取EMB 42.5ｇ，加入1L蒸餾水，在121℃、0.15MPa高壓滅菌20min，制備含培養基的平皿備用。大腸桿菌37℃靜置培養48ｈ，其菌落呈現亮紫色。

1.3 試驗設計及動物的飼養管理

     試驗選擇品種相同（長白×大白×杜洛克三元雜交）、出生日期和體質量相近的仔豬15窩，每窩選擇8頭，共120頭仔豬，分為4個處理組，每個處理組15個重復，每個重復2頭仔豬（公母各半）。對照組，灌服生理鹽水；試驗Ⅰ組：灌服干酪乳桿菌培養液；試驗Ⅱ組：灌服糞腸球菌培養液；試驗Ⅲ組：灌服干酪乳桿菌和糞腸球菌混合培養液。

    試驗從仔豬出生開始持續至21日齡斷奶，并延續1周，試驗期為28ｄ。所選仔豬均在同一豬舍內，舍內清潔干燥、通風良好，舍內溫度和相對濕度分別為（25±2）℃和65％～70％。仔豬保育箱內第1周和第2周溫度分別為（33±2）℃和（30±2）℃，然后維持在（25±2）℃。試驗期間飼養管理和免疫程序均按規模化豬場統一要求執行。仔豬出生第1天灌服1mL益生菌制劑，以后每隔7ｄ灌服1次，每次遞增1mL至21日齡，對照組灌服生理鹽水。仔豬7日齡后開始添加教槽料至28日齡，期間自由采食和飲水。

1.4 生長性能的測定

    在仔豬出生后，稱取每頭仔豬的初始體質量；在21，28日齡時，分別稱取每頭仔豬的體質量，并計算仔豬的日增重。每天觀察仔豬精神狀態及腹瀉情況（以糞樣顏色及是否水樣等為準），計算腹瀉率及死亡率。腹瀉率＝仔豬腹瀉頭次／試驗頭數／試驗天數×100％；死亡率＝仔豬死亡頭數／試驗頭數×100％。

1.5 胃腸道消化酶活性和pH值的測定

    選擇對照組和復合益生菌組21日齡仔豬各3頭，心臟放血處死，采集消化道各段的內容物各5ｇ，分別于4℃和－20℃保存，用于測定各腸道內容物中微生物數量和消化酶活性。蛋白酶的測定參照國家標準（1999）推薦的中性蛋白酶活的測定方法，即福林法。蛋白酶活性的定義為：在40℃條件下，每1min產生1μｇ酪氨酸定義為1個蛋白酶活力單位（U）。蛋白酶活（U／ｇ）＝測得的酪氨酸含量／反應時間×4×樣品稀釋倍數／樣質量。淀粉酶活性采用DNS法，淀粉酶活性定義為每1min產生1ｍｇ葡萄糖所用酶量為1個酶活力單位（U）。淀粉酶活（U／ｇ）＝樣品中還原糖含量×樣品稀釋液總體積×稀釋倍數／樣品質量／測定所用酶體積／5。另外，取適量胃腸道內容物于試管中，用pHＳ－2Ｃ酸度計測定樣品pH值。

1.6 糞樣及胃腸道微生物菌群的測定

    于21，28日齡，每組分別采集5頭仔豬的無污染糞樣5ｇ，于4℃保存，用于乳酸菌和大腸桿菌的活菌數測定。具體操作如下：分別準確稱取0.5ｇ樣品加入4.5mL生理鹽水（稀釋液測定大腸桿菌）或MRS溶液（稀釋液測定乳酸菌），依次進行10倍梯度稀釋至1×10^-6。采用稀釋涂布平板法和伊紅－美藍固態培養基測定大腸桿菌活菌數；利用厭氧管和固態MRS培養基測定乳酸菌活菌數。2種菌分別在37℃培養48ｈ，然后進行計數。

1.7 血清生化指標的測定

   在仔豬21日齡斷奶當天，每組選取5頭仔豬進行前腔靜脈采血，血液于4℃傾斜放置過夜，分離上層血清于－20℃保存備用。利用全自動血液生化分析儀進行血清各項指標的測定。

1.8 數據統計和分析

    數據分析采用SPSS軟件進行方差統計分析，各處理組間平均值采用Duncan氏多重比較進行差異顯著性檢驗，結果用（ｘ±ｓｘ）表示，以P<0.05表示差異顯著。

2.1 益生菌對哺乳仔豬生產性能的影響

2.1.1 益生菌對哺乳仔豬增重的影響

    由表1可知，試驗組仔豬21，28日齡平均日增重均顯著高于對照組（P<0.05），其中以試驗Ⅲ組最高，3個試驗組之間差異不顯著（P>0.05）。