枯草芽孢桿菌B6 的特性及其對哺乳期母豬生產性能的影響
文章旨在報道一株極具益生菌開發潛力的枯草芽孢桿菌B6，通過實驗確定了該菌株高產功能性果聚糖的最佳碳源為蔗糖，果聚糖作為B.subtilis B6的主要功能性代謝產物，其胞外產量在100g/Ｌ以上，經實驗驗證，該菌株產生的果聚糖具有很強的抗氧化作用，10 mg/mＬ果聚糖的DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率分別為80%和71%以上，鐵還原能力達到43.26mmol/gFeSO4當量。B.subtilis B6顯示了活菌數高，菌種性能強，生產成本低等優良的應用特性。哺乳期母豬的飼喂效果顯示B.subtilis B6液體菌劑可使仔豬平均窩重提高28.8%，平均斷奶窩重提高18%，顯著提高母豬及仔豬免疫力。綜上，菌株B.subtilis B6作為特效益生菌在飼料添加劑領域將具有很大的開發潛能和市場價值。
枯草芽孢桿菌是目前畜牧養殖業中應用較為廣泛的益生菌。枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis )屬于革蘭氏陽性、好氧型桿狀細菌，是公認安全(GenerallyRecognized As Safe，GRAS)菌株。該菌種在自然界中分布廣泛，其產生的次生代謝產物種類多，抑菌活性強、抑菌譜廣，同時具有激活免疫、促生長等功能特性，顯示了很好的飼用益生菌的應用潛力。
微生物來源的胞外多糖具有抗腫瘤、抗糖尿病、降血脂、提高免疫力等多種生物學功能，如來源于解淀粉芽孢桿菌的胞外多糖能夠抑制胃癌細胞MC-4和SGC-7901生長活性；來源于解淀粉芽孢桿菌LPL061的多糖具有免疫調節作用，其發酵產率為4.46g/Ｌ；Cellulomonas sp . GJT07發酵優化后果聚糖產量為15g/Ｌ。
本文以一株高產功能性果聚糖的枯草芽孢桿菌為研究對象，對菌株發酵產果聚糖的發酵條件、果聚糖的功能活性，以及該菌株的應用特性及其對孕期母豬的飼喂效果進行了系統研究，為開發一株具有獨特性能的新型益生菌劑奠定了良好的理論基礎。
1材料與方法
1.1
菌種及發酵培養基
枯草芽孢桿菌B6（Bacillus subtilis B6）菌株由本實驗室篩選保存。
發酵培養基成分：400g/Ｌ 蔗糖、25g/Ｌ可溶性淀粉、5g/Ｌ酵母浸粉、磷酸氫二鉀1g/Ｌ、氯化鈉10g/Ｌ、氯化鈣0.3g/Ｌ、硫酸鋅0.01g/Ｌ、硫酸亞鐵0.03g/Ｌ、硫酸錳0.1g/Ｌ和硫酸鎂1g/Ｌ。
1.2液體發酵
① 一級種子液制備：取甘油管中保存的菌液按照2‰的接種量接種于20 mＬLB 培養基中，37 ℃、220r/min震蕩培養10~12 h。
② 二級種子液制備：將一級種子液按照2%的接種量接種于200 mＬLB培養基中，37 ℃、200 r/min震蕩培養10~12 h。
③ 三級種子液制備：將二級種子液接種至5 L發酵培養基中37 ℃、pH值7.0培養至DO上升。
④ 100L種子液制備：將三級種子液接種至100L發酵培養基中37 ℃、pH值7.0培養。罐壓0.05 MPa，通氣150~300L/min，初始轉速150 r/min。設定轉速串聯溶氧（40%），最高轉速450r/min。培養至溶氧開始上升，pH值偏堿時，進行移種。
⑤ 1000L罐發酵：配制300L（滅菌后400 L）發酵培養基115 ℃滅菌。將100 L種子液移種至1000 L發酵罐中，恒溫37 ℃、pH值7.0，初始通氣800L/min（最大為1500 L/min），初始轉速150r/min（最大轉速為350 r/min）。設定轉速串聯溶氧（30%）。
⑥ 計數與檢測：在發酵過程中每隔6h取一份菌液樣品，檢測OD600數值，以10為梯度分別稀釋至一定倍數后進行平板涂布，放入37 ℃溫箱培養9 h后計數。一份直接涂布，另一份80 ℃水浴10 min以后再涂布。
1.3抗氧化能力測定
① ABTS 自由基清除能力測試：100μＬ樣品溶液與3000μＬ由磷酸鹽緩沖液(10mmol/Ｌ，pH 值7.4)稀釋的ABTS 自由基溶液(其在734nm 處吸光值為0.70±0.02)快速混勻后，避光反應6min，測定反應液在734nm處的吸光度。按照公式（1）計算ABTS自由基清除率。
ABTS 自由基清除率（%）=（Ablank-Asample）/Ablank×100 ------ (1)
式中： Ablank——空白樣品吸光度；
Asample——測試樣品吸光度。
解淀粉芽孢桿菌果聚糖測試濃度為25 mg/mＬ。
② DPPH自由基清除能力測試：1mＬ樣品溶液、1mＬ由無水乙醇配制0.2 mmol/Ｌ的DPPH溶液和1mＬ二次水快速混勻后，避光反應30 min，測定反應液在517nm處的吸光值。按照公式(2)計算DPPH自由基清除率。
DPPH 自由基清除率（%）=（Ablank-Asample）/Ablank×100------(2)
式中：Ablank——空白樣品吸光度；
Asample——測試樣品吸光度。
③ 鐵還原能力測試：取100μＬ樣品溶液與3mＬ鐵還原(FRAP)試劑混勻后于37 ℃水浴中反應5min，測定593nm處吸光值。同時取濃度0~1.0 mmol/Ｌ的FeSO4溶液各100μＬ代替樣品反應，以593nm處吸光值為縱坐標，FeSO4濃度為橫坐標，制作標準曲線。通過標準曲線計算樣品對應的FeSO4濃度，表示鐵還原能力。
1.4
孕期母豬飼喂實驗
選擇胎次接近、健康狀況良好的長白哺乳母豬48頭，平均分成兩組，每組24頭，實驗從產仔前30d至哺乳仔豬22日齡斷奶結束，對照組為基礎日糧，益生組每日添加1mＬB.subtilis B6液體菌劑。
2 結果與討論
2.1 枯草芽孢桿菌B6液體發酵高產果聚糖
前期研究發現枯草芽孢桿菌B6 發酵過程中可產生具有良好生物活性的功能多糖，并鑒定其主要成分為果聚糖。本文通過實驗進一步了解不同碳源對枯草芽孢桿菌發酵產功能性低碳的影響，分別以400g/Ｌ的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、果糖為發酵培養基的碳源，其他成分不變。以2%的接種量于37℃、200 r/min 條件下培養24h，結果如表1所示，B.subtilis B6 發酵高效生產果聚糖需以蔗糖為主要的培養基成分，應用優化后的培養基成分及發酵條件，發酵培養24h枯草芽孢桿菌活菌數達到1×10^10~1×10^11CFU/mＬ，發酵液中功能多糖（果聚糖）含量≥100g/Ｌ。如此高的果聚糖產量在枯草芽孢桿菌中并不多見，也正是由于其高產功能多糖的代謝特性，使得B.subtilis B6顯示了良好的益生菌活性。
據報道果聚糖作為功能性多糖，通常具有抗氧化和抗腫瘤等生物學活性，本文應用DPPH 自由基清除、ABTS 自由基清除與鐵還原能力指標來評價枯草芽孢桿菌B6 所產果聚糖的抗氧化活性。結果如表2 所示，隨枯草芽孢桿菌B6 果聚糖濃度的提高，其抗氧化能力隨之增強，當果聚糖濃度達到10mg/mＬ，其DPPH 自由基清除率和ABTS 自由基清除率分別達到80%和70%以上，鐵還原能力也達到抗氧化劑組鐵還原能力的69.6%。可見，枯草芽孢桿菌B6 果聚糖具有較強的抗氧化能力，作為益生菌產生的重要代謝產物，對于清除動物體內自由基、提高免疫力、改善體質、提高抗病性將具有顯著效果。
本文對B.subtilis B6的主要應用性能指標進行了詳細測定，結果見表3所示，經過分析，枯草芽孢桿菌B6具有活菌數高，菌種性能強，生產成本低等諸多優勢。同時，該菌株在生長過程中可產生淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶等消化酶類，可加強宿主體內的營養代謝。作為益生菌應用，B.subtilis B6也顯示了良好的抗胃酸和耐高溫等抗逆性能，其保存穩定及有效性也很優秀，因此，B.subtilis B6顯示了非常良好的益生菌劑開發應用潛力。
應用B.subtilis B6液體菌劑飼喂哺乳期母豬，結果如表4所示，與對照組相比，飼喂B.subtilis B6液體菌劑的母豬生產平均健仔數相對高，弱仔及死胎率相對低，平均窩重提高了28.8%，說明該益生菌劑對母豬生產具有顯著的有益效果；同時，平均斷奶窩重也較對照組提高了18%，通過觀察，飼喂B.subtilis B6液體菌劑的仔豬精神相對較好，顯著緩解仔豬腹瀉，可見B.subtilis B6液體菌劑具有顯著提高母豬及仔豬免疫力的功效。
本文針對一株高產果聚糖的枯草芽孢桿菌B6及其應用做了系統研究，該菌株作為飼用益生菌劑可產生功能性果聚糖作為良好的抗氧化劑，可增強動物機體免疫力和抗病性。菌株在生長過程中還可產生淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶等消化酶類，可加強宿主體內的營養代謝。應用該活體菌劑飼喂孕期母豬，可顯著提高窩重，仔豬精神相對更好，顯著緩解仔豬腹瀉，顯著提高母豬及仔豬免疫力。可見，枯草芽孢桿菌B6具有良好的益生菌開發潛力。
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