混合菌種兩步發酵法對豆粕肽轉化及品質的影響
豆粕，又稱“大豆粕”是大豆提取豆油后所得的一種副產品，它的營養成分主要有蛋白質、脂肪、碳水化合物，以及多種礦物質、纖維素和必需氨基酸，是一種營養豐富、營養成分種類齊全、營養物質含量均衡的植物性蛋白飼料源。但是豆粕所含蛋白質中的水溶性蛋白質占據很大比重，由于這些水溶性蛋白質分子量較大、結構復雜，如果直接將豆粕用于飼養動物，豆粕中的蛋白質被消化吸收利用率不高，就會造成豆粕資源浪費，從而提高了飼養成本，限制了豆粕的廣泛應用。因此，降解豆粕蛋白才能進一步提高豆粕的營養性能和使用價值，擴大豆粕的使用范圍。
作為降解蛋白質效果來看，對豆柏進行微生物發酵處理是最理想的方法。微生物發酵的原理是利用微生物在發酵過程中可產生呼吸酶、發酵酶和水解酶，可以分解豆粕蛋白產生小肽。因此，國內外學者對發酵豆柏開展了大量研究。楊柳等采用枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、植物乳桿菌混合固態發酵豆粕，可獲得可溶性蛋白質的含量為165.8μmol/g，大豆球蛋白的含量為11.4μmol/g。張良等采用米曲霉、枯草芽孢桿菌、根霉和酵母菌，進行混合菌固態發酵生產大豆肽的含量達17.97%。吳寶昌等對枯草芽飽桿菌與黑曲霉混合發酵制備豆粕飼料的條件進行研究，在最優條件下測得發酵豆粕的肽轉化率值為40.8%。Laura等用12株對乳酸菌發酵豆粕研究發現，大部分乳酸菌可降解大豆蛋白并提高了游離氨基酸、主要必需氨基酸和風味氨基酸前體含量。
本試驗以大豆肽的轉化率為試驗標準，利用枯草芽孢桿菌、黑曲霉、釀酒酵母和保加利亞乳酸桿菌，進行混合菌固態發酵生產大豆肽，利用種間互惠、偏利共生等關系，進行協同發酵。該方法成本低，是代替酶解蛋白和酸解蛋白較好的方法。
1材料與方法
1.1 材料
豆粕：益海嘉里（安徽）糧油工業有限公司購買（水分為7.66 %、粗蛋白為40.60 %、脂肪為3.51 %、灰分為5.89 %及碳水化合物為42.34 %）。
菌種：枯草芽孢桿菌、黑曲霉、啤酒酵母和保加利亞乳酸桿菌均由來自安徽農業大學微生物實驗室保藏。
LB培養液：牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、pH7.0～7.2，經121 ℃蒸汽滅菌30 min 備用。
察氏培養液：杭州百思生物技術有限公司提供。MRS培養液：杭州百思生物技術有限公司提供。
1.2 主要設備
凱氏定氮儀： 濟南海能儀器有限公司；GZX-9146MBE 數顯鼓風干燥箱：上海博訊實業有限公司醫療設備；DL-5-B飛鴿牌離心機：上海安亭科學儀器廠；SWCJ-1D 超凈工作臺： 江蘇通凈設備公司；PHSJ-4A PH計：合肥原點生物科技有限公司；ML204/02 電子天平：梅特勒托利多儀器（上海）有限公司；SHA-C 水浴恒溫震蕩器：金壇市杰瑞爾電器有限公司；UV-180 型紫外分光光度機：上海美譜達儀器公司；DHP-9162 型電熱恒溫培養箱：上海一恒科技有限公司；LDZX-30KBS 立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；KNT-IV-10超純水機：北京塞多利斯科儀器廠；DFT-100 多功能中藥粉粹機：溫嶺市大德中藥機械有限公司。
1.3 方法
1.3.1 生長曲線的測定方法
取裝有培養液的250 mL 錐形瓶，貼上標簽（注明菌名、培養處理）。按無菌操作法用接種環挑取單菌落加入于培養液中。將接種后的培養基置于振蕩培養箱中，在適應的溫度條件下培養，分別光電比濁測定4種菌種的生長曲線，確定其對數生長期。
1.3.2 豆粕第一步發酵單因素試驗及正交試驗的方法
本試驗主要確定混合菌種（枯草芽孢桿菌和黑曲霉）第一步發酵法最優方法，考察發酵時間、發酵溫度、接種量、培養基含水量和菌種體積比例對大豆肽轉化率的影響。
1.3.2.1 第一步單因素試驗設計
1）發酵時間對大豆肽轉化率影響
總接種量為8 %，菌種體積比例為1 ∶ 1，發酵溫度為34 ℃，發酵培養基的含水量為55 %設為初始條件，發酵時間分別設定為48、60、72、84、96 h， 考察發酵時間對大豆肽轉化率影響。
2）發酵溫度對大豆肽轉化率影響
總接種量為8 %，菌種體積比例為1 ∶ 1，發酵時間為72 h， 發酵培養基的含水量為55 %設為初始條件，發酵溫度分別設定為30、32、34、36、38 ℃，考察發酵溫度對大豆肽轉化率影響。
3）發酵培養基的含水量對大豆肽的轉化率影響
總接種量為8 %， 菌種體積比例為1 ∶ 1， 發酵時間為72 h，發酵溫度為34 ℃，設為初始條件，發酵培養基的含水量分別設定為45 %、50 %、55 %、60 %、65 %，考察發酵培養基的含水量對大豆肽轉化率影響。
4）總接種量對大豆肽轉化率影響
菌種體積比例為1 ∶ 1，發酵時間為72 h，發酵溫度為34 ℃，發酵培養基的含水量為55 %設為初始條件，總接種量分別設定為4 %、6 %、8 %、10 %、12 %，考察總接種量對大豆肽轉化率影響。
5）菌種體積比例對大豆肽轉化率影響
總接種量為8 %， 發酵時間為72 h， 發酵溫度為34 ℃， 發酵培養基的含水量為55 %設為初始條件，菌種體積比例（枯草芽孢桿菌∶黑曲霉）分別設定為1 ∶ 3、1 ∶ 2、1 ∶ 1、2 ∶ 1、3 ∶ 1，考察菌種體積比例對大豆肽轉化率影響。
1.3.2.2 第一步發酵正交試驗設計
根據第一步發酵單因素試驗得到的結果和Box-Behnken 中心組合試驗設計原理， 通過Design Expert軟件對本試驗展開設計以及數據分析處理，并檢驗其有效性。
1.3.3 豆粕第二步發酵單因素試驗及正交試驗的方法
本試驗主要確定混合菌種（保加利亞乳酸桿菌和啤酒酵母）第二步發酵法最優方法，考察發酵時間、發酵溫度、接種量、培養基含水量和菌種體積比例對大豆肽轉化率的影響。
1.3.3.1 第二步發酵單因素試驗設計
1）發酵時間對大豆肽轉化率影響
總接種量為6 %，菌種體積比例為1 ∶ 1，發酵溫度為34 ℃，發酵培養基的含水量為40 %設為初始條件，發酵時間分別設定為24、36、48、60、72 h， 考察發酵時間對大豆肽轉化率影響。
2）發酵溫度對大豆肽轉化率影響
總接種量為6 %，菌種體積比例為1 ∶ 1，發酵時間為48 h， 發酵培養基的含水量為40 %設為初始條件，發酵溫度分別設定為30、32、34、36、38 ℃，考察發酵溫度對大豆肽轉化率影響。
3）發酵培養基的含水量對大豆肽轉化率影響
總接種量為6 %，菌種體積比例為1 ∶ 1，發酵時間為48 h，發酵溫度為34 ℃設為初始條件，發酵培養基的含水量分別設定為30 %、35 %、40 %、45 %、50 %，考察發酵培養基的含水量對大豆肽轉化率影響。
4）總接種量對大豆肽轉化率影響
菌種體積比例為1 ∶ 1，發酵時間為48 h，發酵溫度為34 ℃，發酵培養基的含水量為40 %設為初始條件，總接種量分別設定為2 %、4 %、6 %、8 %、10 %， 考察總接種量對大豆肽轉化率影響。
5）菌種體積比例對大豆肽轉化率影響
總接種量為6 %， 發酵時間為48 h， 發酵溫度為34 ℃，發酵培養基的含水量為40 %，設為初始條件，菌種體積比例（保加利亞乳酸桿菌∶ 釀酒酵母）分別設定為1 ∶ 3、1 ∶ 2、1 ∶ 1、2 ∶ 1、3 ∶ 1， 考察菌種體積比例對大豆肽轉化率影響。
1.3.3.2 第二步發酵正交試驗設計
根據第二步發酵單因素試驗得到的結果和Box-Behnken 中心組合試驗設計原理， 通過Design Expert軟件對本試驗展開設計以及數據分析處理，并檢驗其有效性。
1.3.3 豆粕第二步發酵單因素試驗及正交試驗的方法
本試驗主要確定混合菌種（保加利亞乳酸桿菌和啤酒酵母）第二步發酵法最優方法，考察發酵時間、發酵溫度、接種量、培養基含水量和菌種體積比例對大豆肽轉化率的影響。
1.3.3.1 第二步發酵單因素試驗設計
1）發酵時間對大豆肽轉化率影響
總接種量為6 %，菌種體積比例為1 ∶ 1，發酵溫度為34 ℃，發酵培養基的含水量為40 %設為初始條件，發酵時間分別設定為24、36、48、60、72 h， 考察發酵時間對大豆肽轉化率影響。
2）發酵溫度對大豆肽轉化率影響
總接種量為6 %，菌種體積比例為1 ∶ 1，發酵時間為48 h， 發酵培養基的含水量為40 %設為初始條件，發酵溫度分別設定為30、32、34、36、38 ℃，考察發酵溫度對大豆肽轉化率影響。
3）發酵培養基的含水量對大豆肽轉化率影響
總接種量為6 %，菌種體積比例為1 ∶ 1，發酵時間為48 h，發酵溫度為34 ℃設為初始條件，發酵培養基的含水量分別設定為30 %、35 %、40 %、45 %、50 %，考察發酵培養基的含水量對大豆肽轉化率影響。
4）總接種量對大豆肽轉化率影響
菌種體積比例為1 ∶ 1，發酵時間為48 h，發酵溫度為34 ℃，發酵培養基的含水量為40 %設為初始條件，總接種量分別設定為2 %、4 %、6 %、8 %、10 %， 考察總接種量對大豆肽轉化率影響。
5）菌種體積比例對大豆肽轉化率影響
總接種量為6 %， 發酵時間為48 h， 發酵溫度為34 ℃，發酵培養基的含水量為40 %，設為初始條件，菌種體積比例（保加利亞乳酸桿菌∶ 釀酒酵母）分別設定為1 ∶ 3、1 ∶ 2、1 ∶ 1、2 ∶ 1、3 ∶ 1， 考察菌種體積比例對大豆肽轉化率影響。
1.3.3.2 第二步發酵正交試驗設計
根據第二步發酵單因素試驗得到的結果和Box-Behnken 中心組合試驗設計原理， 通過Design Expert軟件對本試驗展開設計以及數據分析處理，并檢驗其有效性。
1.4 蛋白質及肽的轉化率測定方法
1.4.1 蛋白質測定方法
采用凱氏定氮測定。
1.4.2 肽的轉化率測定方法
大豆肽轉化率/%=酸溶蛋白含量/原豆粕蛋白含量×100酸溶蛋白含量：采用三氯乙酸法測定。
2結果與分析
2.1 種子擴培時間的確定
種子擴大培養是發酵工程一個重要的組成部分，本試驗將冷凍干燥管中處休眠狀態的生產菌種接入液體培養基中，通過培養一段時間后獲得一定數量和質量的菌種。4種菌種的生長曲線見圖1。
通過圖1 可以得出4 種菌種種子擴培時間，4 條曲線分別為枯草芽孢桿菌20 h，黑曲霉32 h，釀酒酵母菌18 h，保加利亞乳酸桿菌18 h。
2.2 第一步發酵單因素試驗及正交試驗結果
2.2.1 第一步發酵單因素試驗結果
圖2為第一步發酵時間對大豆肽轉化率的影響。
由圖2能夠看出，當發酵時間從48 h延長至72 h，隨著發酵時間的延長，微生物大量繁殖，分解豆粕中的蛋白質的速度加快，使大豆肽含量增加，是由于混菌之間為協同關系共同產生蛋白酶水解大豆蛋白，這是前72 h大豆肽轉化率快速上升的主要原因。當發酵時間超過72 h 時，大豆肽轉化率基本保持不變。
圖3為第一步發酵溫度對大豆肽轉化率的影響。
由圖3 能夠看出，當溫度從30 ℃升高到36 ℃時，大豆肽的轉化率也在平緩增加。這是由于溫度上升，導致枯草芽孢桿菌和黑曲霉的生長繁衍加快，而且隨溫度升高枯草芽孢桿菌和黑曲霉產生的蛋白酶能夠加快分解大豆蛋白速度。當溫度超過36 ℃時，大豆肽的產量有下降的趨勢，是因為偏高的溫度抑制枯草芽孢桿菌和黑曲霉正常的生長代謝，同時損壞枯草芽孢桿菌和黑曲霉產生的分解大豆蛋白的蛋白酶功能，最后使得大豆肽的轉化率值略微下降。
圖4為第一步發酵培養基的含水量對大豆肽轉化率的影響。
由圖4 能夠看出，發酵培養基的含水量從45 %上升到60 %過程中，大豆肽轉化率也呈現出逐步上升現象。這是因為水分是維持枯草芽孢桿菌和黑曲霉正常的生理活動的必要生命營養物質，同時也是能提高枯草芽孢桿菌和黑曲霉產生分解豆粕蛋白的蛋白酶活力。當發酵培養基的含水量超過60 %，大豆肽轉化率急劇下降。這是因為過多的水分可能影響枯草芽孢桿菌和黑曲霉細胞膜的通透性，從而影響枯草芽孢桿菌和黑曲霉生產蛋白酶功能，所以導致大豆肽轉化率下降。
圖5 為第一步發酵總接種量對大豆肽轉化率的影響。
由圖5 能夠看出，總接種量從4 %到8 %時，大豆肽轉化率是按照一定的比例增長。這是因為加大枯草芽孢桿菌和黑曲霉接種量，使得枯草芽孢桿菌和黑曲霉生產分解大豆蛋白的蛋白酶的量增多。當總接種量超過8 %時，大豆肽轉化率下降。這是因為接種枯草芽孢桿菌和黑曲霉量過大，致使枯草芽孢桿菌和黑曲霉生長速度過快，從而消耗大量的營養物質，從而導致大豆肽含量下降。
圖6 為第一步發酵菌種體積比例對大豆肽轉化率的影響。
由圖6能夠看出， 隨著枯草芽孢桿菌占總接種量的比例逐漸增大，大豆肽轉化率呈現升高趨勢。這種現象可能的原因是枯草芽孢桿菌比黑曲霉生產分解大豆蛋白的蛋白酶的量多，或者枯草芽孢桿菌比黑曲霉生產蛋白酶分解大豆蛋白的能力更強。因此，發酵菌種體積比例為2 ∶ 1時大豆肽轉化率最高。
2.2.2 第一步發酵正交試驗結果分析
通過正交試驗， 以大豆肽的轉化率為參考指標，來研究這四因素三水平對大豆肽的轉化率的影響程度，見表3、表4。
通過表3、表4能夠得出，最適水平組合為A1B2C3D3，即發酵溫度為34 ℃，培養基的含水量為60 %，總接種量為10 %，菌種體積比例為3 ∶ 1。分別對大豆肽轉化率影響的4 個因素順序為：B（發酵培養基的含水量）>C（總接種量）>D（菌種比例）>A（發酵溫度）。由方差分析表顯示：發酵培養基的含水量、總接種量和菌種比例3個因素都具有顯著性。2.2.3 驗證試驗對最優組合A1B2C3D3驗證試驗，作3 個平行，結果取平均值，驗證試驗結果為52.01 %，同試驗理論結果接近。
2.3 第二步發酵單因素試驗及正交試驗結果
2.3.1 第二步發酵單因素試驗結果
圖7為第二步發酵時間對大豆肽轉化率的影響。
由圖7能夠看出，當發酵時間從24 h延長至48 h，隨著發酵時間的延長，微生物大量繁殖，分解豆粕中的蛋白質的速度加快，使大豆肽含量增加，是由于混菌之間為協同關系共同產生蛋白酶水解大豆蛋白，這是前48 h大豆肽轉化率快速上升的主要原因。當發酵時間超過48 h 時，大豆肽略有下降。可能原因是發酵后期釀酒酵母和保加利亞乳酸桿菌發生自溶現象，另一原因是隨著發酵時間的延伸，豆粕中的營養物質不足以使釀酒酵母和保加利亞乳酸桿菌開始變為競爭關系而相互抑制。
圖8 為第二步發酵溫度對大豆肽轉化率的影響。
由圖8 能夠看出，當溫度從30 ℃升高到36 ℃時，大豆肽轉化率也在逐漸增加。這是由于溫度上升，導致釀酒酵母和保加利亞乳酸桿菌的生長繁衍加快，而且隨溫度升高釀酒酵母和保加利亞乳酸桿菌的蛋白酶能加快分解大豆蛋白速度。當溫度超過36 ℃時，大豆肽含量急速下降，是因為過高的溫度抑制釀酒酵母和保加利亞乳酸桿菌生長代謝，同時損壞釀酒酵母和保加利亞乳酸桿菌產生的分解大豆蛋白的蛋白酶功能，最后使得大豆肽轉化率值變小。
圖9為第二步發酵培養基的含水量對大豆肽轉化率的影響。
由圖9能夠看出， 發酵培養基的含水量從30 %上升到45 %過程中，大豆肽轉化率也呈現出逐步上升現象。這是因為水分是維持釀酒酵母和保加利亞乳酸桿菌正常的生理活動的必要生命營養物質，同時也是能提高釀酒酵母和保加利亞乳酸桿菌產生分解豆粕蛋白的蛋白酶活力。當發酵培養基的含水量超過45 %，大豆肽轉化率急劇下降。這是因為過多的水分可能影響釀酒酵母和保加利亞乳酸桿菌細胞膜的通透性，會進一步影響釀酒酵母和保加利亞乳酸桿菌生產蛋白酶功能，所以大豆肽轉化率下降。
圖10 為第二步發酵總接種量對大豆肽轉化率的影響。
由圖10 能夠看出， 總接種量從2 %到8 %時，大豆肽的轉化率是按照一定的比例增長。這是因為加大釀酒酵母和保加利亞乳酸桿菌接種量，使得釀酒酵母和保加利亞乳酸桿菌生產分解大豆蛋白的蛋白酶的量增多。當總接種量超8 %時，大豆肽轉化率呈下降趨勢。這是因為接種釀酒酵母和保加利亞乳酸桿菌量過大， 致使釀酒酵母和保加利亞乳酸桿菌生長速度過快，從而消耗大量的營養物質，從而導致大豆肽轉化率呈現下降趨勢。
圖11 為第二步發酵菌種體積比例對大豆肽轉化率的影響。
由圖11 能夠看出，隨著保加利亞乳酸桿菌占總接種量的比例逐漸增大,大豆肽轉化率呈現升高趨勢,當菌種體積比為2 ∶ 1時肽轉化率最高, 此時大豆肽轉化率最大值為63.43 %。這種現象可能的原因是保加利亞乳酸桿菌比釀酒酵母生產分解大豆蛋白的蛋白酶的量多，或者保加利亞乳酸桿菌比釀酒酵母生產蛋白酶分解大豆蛋白的能力更強。
2.3.2 第二步發酵正交試驗結果
通過正交試驗， 以大豆肽的轉化率為參考指標，來研究這四因素對大豆肽的轉化率的影響程度，見表5、表6。
通過表5、表6 能夠得出， 最適水平組合為A2B2C1D2，即菌種體積比例為2 ∶ 1、發酵溫度為36 ℃，培養基的含水量為40 %，接種量為8 %。分別對大豆肽的轉化率影響的4 個因素順序為：A（菌種比例）>B（溫度）>C（發酵培養基的含水量）>D（總接種量）且菌種比例、發酵溫度和培養基的含水量3 個因素都具有顯著性。
2.3.3 驗證試驗
對最優組合A2B2C1D2驗證試驗，作3個平行，結果取平均值，驗證試驗結果為65.08 %，同試驗理論結果接近。
3討 論
本試驗研究得出了兩步固態發酵豆粕的最佳工藝條件：以壓榨的豆粕為原料，并進行60 目粉碎，首先試驗選用的菌種為枯草芽孢桿菌和黑曲霉對豆粕進行有氧發酵，確定最優條件：發酵溫度是34 ℃，發酵培養基的含水量是60 %，總接種量是10 %，發酵時間是72 h，菌種體積比例是3 ∶ 1。枯草芽孢桿菌在發酵過程中產生水解能力較強的蛋白酶，分解大分子物質為小分子物質，尤其在生長代謝中產生的外肽酶，能夠對豆粕中的苦肽進行分解。黑曲霉發酵豆粕的過程中能夠產生豐富的酶系，如酸性蛋白酶、果膠酶等，能夠更好的作用于豆粕，并且降解豆粕中的多糖，蛋白質和細胞壁，進而提高發酵豆粕的蛋白質含量。然后對第一步發酵后的豆粕進行再發酵，選用的菌種保加利亞乳酸桿菌和釀酒酵母進行厭氧發酵， 確定最優條件：溫度是36 ℃，發酵培養基的含水量是40 %，總接種量是8 %，發酵時間是48 h，確定最優條件菌種體積比例是2 ∶ 1。保加利亞乳酸菌和釀酒酵母菌在發酵豆粕的過程中，產生大量的有機酸，使豆粕的pH 值下將，有利于抑制有害微生物的生長，同時又能進一步分解大豆蛋白，提高大豆肽的濃度。經過兩步發酵豆粕的大豆肽含量為26.42 %與大豆肽轉化率為65.08 %。此結果比劉天蒙等單菌發酵，李善仁等一步混菌發酵的效果更好。由此得出混菌發酵比單菌發酵豆粕效果好，兩步固態發酵比一步固態發酵豆粕效果好。此結論可為發酵豆粕生產大豆肽提供新的試驗依據。
4結 論
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