24株雞源丁酸梭菌的分離鑒定及耐藥基因與毒力基因攜帶情況

2020-09-01 09:35:46 點(diǎn)擊：

摘要: 【目的】旨在對(duì)雞源丁酸梭菌進(jìn)行分離鑒定與安全性評(píng)估。【方法】利用厭氧培養(yǎng)方法對(duì)源自汶上蘆花雞與SPF雞糞便樣品進(jìn)行丁酸梭菌的分離與純化，挑選可疑菌落進(jìn)行微生物質(zhì)譜鑒定，進(jìn)一步通過(guò)16S rRNA基因測(cè)序進(jìn)行鑒定，16S rRNA測(cè)序結(jié)果與NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)中丁酸梭菌的16S rRNA序列進(jìn)行同源性分析；同時(shí)，進(jìn)行所有分離株對(duì)氧氟沙星、頭孢吡肟等9種藥物的藥敏試驗(yàn)，利用PCR方法進(jìn)行mefA等23種耐藥基因，基于益生菌安全要求對(duì)樣品進(jìn)行alpha等4種梭菌毒素基因以及typeA等4種肉毒毒素基因的測(cè)定。【結(jié)果】共分離鑒定了24株丁酸梭菌。24株均對(duì)氧氟沙星等7種抗生素表現(xiàn)為敏感，L-1、L-6、L-12僅對(duì)新霉素表現(xiàn)為中介，L-19僅對(duì)頭孢吡肟表現(xiàn)為中介。全部菌株的mefA等16種耐藥基因結(jié)果全部為陰性，sul2、flor、blaTEM3種耐藥基因全部呈陽(yáng)性，tetC攜帶率為79.2%，cmlA攜帶率為45.8%，blaOXA攜帶率為37.5%，aadB攜帶率為12.5%，qnrA攜帶率為4.2%。PCR結(jié)果顯示所有分離菌株的alpha、beta、epsilon、iota等4種梭菌毒素基因攜帶率0%。全部分離菌株均未攜帶typeA、typeB、typeE、typeF4種肉毒毒素基因。【結(jié)論】結(jié)果表明，從未飼喂抗生素和丁酸梭菌的汶上蘆花雞與SPF雞群中獲得的24株丁酸梭菌分離株達(dá)到預(yù)期的安全性要求，可作為益生添加菌的篩選參考株。

丁酸梭菌歸屬于梭菌屬，是一種產(chǎn)芽孢，周生鞭毛的革蘭陽(yáng)性菌，細(xì)胞直或稍彎，內(nèi)生孢子卵圓,偏心或次端生,培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣。丁酸梭菌對(duì)各種外界條件的抵抗能力強(qiáng)，具有耐酸、耐膽鹽和耐高溫等特性。作為一種常見(jiàn)的人和動(dòng)物腸道共生細(xì)菌，也經(jīng)常在環(huán)境中發(fā)現(xiàn)。有文獻(xiàn)指出部分丁酸梭菌會(huì)產(chǎn)梭菌毒素或肉毒毒素，且報(bào)道多與E型肉毒毒素有關(guān)，如：攜帶typeE丁酸梭菌被認(rèn)為是嬰兒肉毒中毒或早產(chǎn)兒壞死性小腸結(jié)腸炎的原因之一。丁酸梭菌是嚴(yán)格厭氧菌，已有研究表明丁酸梭菌出現(xiàn)耐氧性并可能與E型肉毒毒素基因有關(guān)，非產(chǎn)毒菌株目前在亞洲被用作益生菌，丁酸可增強(qiáng)斷奶仔豬腸屏障功能，在國(guó)內(nèi)2020年起飼料中禁止添加抗生素的大環(huán)境下，丁酸梭菌在畜禽生產(chǎn)中作為一種益生菌制劑具有良好的應(yīng)用前景。依據(jù)IsaK等對(duì)丁酸梭菌CBM588進(jìn)行了7毒素基因的安全性評(píng)估，以及FAO/WHO 2006年頒布的益生菌評(píng)價(jià)指南中提出益生菌耐藥譜和對(duì)人體的安全的要求，我們對(duì)樣品進(jìn)行了更全面的8種毒力基因的PCR檢測(cè)，CBM588在多次安全評(píng)估后于2014年獲得歐盟批準(zhǔn)作為食品原料。目前國(guó)內(nèi)并未對(duì)丁酸梭菌進(jìn)行毒素基因方面的安全性評(píng)估，所以?xún)H以產(chǎn)量與抗逆性作為篩選標(biāo)準(zhǔn)可能會(huì)將攜帶毒素基因的菌株誤作為益生添加，造成潛在風(fēng)險(xiǎn)。本研究對(duì)山東省汶上蘆花雞場(chǎng)與SPF雞場(chǎng)分得的丁酸梭菌進(jìn)行了耐藥、梭菌毒素和肉毒毒素基因方面的安全性評(píng)價(jià)，分析兩家雞場(chǎng)內(nèi)丁酸梭菌野株的耐藥與毒素基因攜帶情況，為后續(xù)優(yōu)良菌株的篩選打下基礎(chǔ)，旨在保護(hù)動(dòng)物健康。

1材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來(lái)源：汶上蘆花雞的新鮮糞樣24份，來(lái)自9月齡公母混養(yǎng)雞群，采用隨機(jī)采樣；SPF雞的新鮮糞樣24份，來(lái)自231日齡公母混養(yǎng)雞群，采用隨機(jī)分樣。兩家種雞飼料中均未添加丁酸梭菌及抗生素，丁酸梭菌A1株為從市場(chǎng)上某飼用菌粉中分離得到的菌株。

1.1.2 主要試劑和儀器：強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基（RCM）；DNA提取試劑盒（TIANGEN生化科技有限公司）；抗生素藥敏片（杭州微生物試劑有限公司）；微生物質(zhì)譜儀（德國(guó)BRUKER）。

1.2 菌株分離

稱(chēng)取每份采集的糞便樣品5g與生理鹽水1:9比例加入到50mL離心管中配成稀釋液，震蕩混勻，水浴85℃，10min后再次震蕩，取稀釋液1mL與RCM培養(yǎng)液以1:4比例加入至5mL離心管中，37℃厭氧增菌48h，再次水浴85℃，10min，重復(fù)1次RCM增菌，以三線(xiàn)法接種于RCM固體培養(yǎng)基，厭氧培養(yǎng)24h。

1.3 菌株鑒定

1.3.1 微生物質(zhì)譜鑒定：挑選菌落邊緣不規(guī)則的疑似菌落進(jìn)行微生物質(zhì)譜鑒定，對(duì)經(jīng)微生物質(zhì)譜儀鑒定結(jié)果為丁酸梭菌的菌落進(jìn)行純化增菌。

1.3.2 16Sr RNA鑒定：提取細(xì)菌基因組DNA，16S通用引物（27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′）委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，對(duì)DNA進(jìn)行16S rRNA的PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系25μL：MIX12.5μL，ddH2O9.5μL，上下游引物各1μL，DNA模板1μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，（95℃，30s，55℃，30s，72℃，1min40s）34×，72℃，5min。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。16SrRNA測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，記錄與分離株比對(duì)結(jié)果最高的16S序列及其頻次。

1.4 16S rRNA基因同源性分析

采用Megalign軟件的CLUSTALW功能將16S rRNA測(cè)序結(jié)果與NCBI核苷酸數(shù)據(jù)中比對(duì)頻次高的丁酸梭菌16S序列：KP944151.1（膿，中國(guó)北京，2015）、KC195777.1（沼氣污泥，中國(guó)，2013）、MK156151.1（海洋沉積，中國(guó)，2018）、MK764959.1（中國(guó)，2019）HQ830243.1（稻田，新加坡，2011）進(jìn)行同源性分析。

1.5 藥敏試驗(yàn)

選用9種對(duì)革蘭陽(yáng)性菌有效的抗生素藥敏片：氧氟沙星、頭孢吡肟、青霉素G、新霉素、呋喃妥因、氟苯尼考、紅霉素、萬(wàn)古霉素、四環(huán)素，以無(wú)菌棉簽將增菌24h的菌液均勻涂布于RCM固體培養(yǎng)基上，每個(gè)20mL培養(yǎng)基上等距離貼三種藥敏紙片，培養(yǎng)基37℃厭氧培養(yǎng)24h后量取抑菌圈直徑，判定參考說(shuō)明。

1.6 耐藥基因測(cè)定

選用不同種類(lèi)抗生素耐藥基因引物大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)：ermB、mefA、mrsD，多肽類(lèi)：vanA、vanB、vanC1，四環(huán)素類(lèi)：tetC、tetD、tetE、tetG，磺胺類(lèi)：sul1、sul2、sul3，酰胺醇類(lèi)：cmlA、flor，β-內(nèi)酰胺類(lèi)：blaPSE、blaTEM、blaSHV、blaOXA，喹諾酮類(lèi)：qnrS、qnrA、oqxA，氨基糖苷類(lèi)：aac（3）-Ia、aadB，共24種耐藥基因，進(jìn)行PCR檢測(cè)，以ddH2O為陰性對(duì)照。sul1、blaSHV、blaOXA參考文獻(xiàn)，引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列及退火溫度見(jiàn)表1。

2結(jié)果與分析

2.1 菌株的鑒定

2.1.1 微生物質(zhì)譜儀鑒定：經(jīng)微生物質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示分離到24株丁酸梭菌（Clostridium butyricum），部分菌株鑒定結(jié)果如表4示。

2.1.2 16S rRNA鑒定結(jié)果：BLAST結(jié)果顯示24株分離株均為丁酸梭菌，其中汶上蘆花雞場(chǎng)分離到21株，SPF雞場(chǎng)分離到3株，統(tǒng)計(jì)比對(duì)結(jié)果最高的NCBI ACCESSION VERSION與頻次如圖5所示。

2.2 菌株的培養(yǎng)特征

對(duì)分離到24株丁酸梭菌，汶上蘆花雞源分離株分別標(biāo)記為：L-1~L-21，SPF雞源分離株分別標(biāo)記為：S-22~S-24。菌株培養(yǎng)產(chǎn)物有臭味，菌落形態(tài)呈不規(guī)則，菌落顏色在RCM培養(yǎng)基呈白色到黃白色，表面光滑，部分分離株如圖1所示。

2.3 同源性分析

部分丁酸梭菌菌株與KP944151.1、KC195777.1、HQ30243.1、MK156151.1、MK764959.1同源性分析如圖2所示，結(jié)果表明丁酸梭菌在同源性上與地理源沒(méi)有明顯相關(guān)性。

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

17株汶上蘆花雞場(chǎng)分離得到的丁酸梭菌與3株SPF雞場(chǎng)分得的丁酸梭菌的藥敏試驗(yàn)中對(duì)氧氟沙星、頭孢吡肟、青霉素G、新霉素、呋喃妥因、氟苯尼考、紅霉素、萬(wàn)古霉素、四環(huán)素全部表現(xiàn)為敏感。L-1、L-6、L-12僅對(duì)新霉素表現(xiàn)為中介，抑菌圈直徑分別為16mm、15mm、16mm，對(duì)其他藥物均表現(xiàn)為敏感；L-19僅對(duì)頭孢吡肟表現(xiàn)為中介，抑菌圈直徑為16mm，對(duì)其他藥物表現(xiàn)為敏感。部分菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，統(tǒng)計(jì)情況如圖4所示。

2.5 耐藥基因結(jié)果

PCR結(jié)果顯示24株丁酸梭菌均不攜帶ermB、mefA、mrsD、vanA、vanB、vanC1、tetD、tetE、tetG、sul1、sul3、blaPSE、blaSHV、qnrS、oqxA、aac（3）-Ia16種耐藥基因。24株丁酸梭菌全部攜帶有磺胺類(lèi)的sul2、酰胺醇類(lèi)的flor以及β-內(nèi)酰胺類(lèi)的blaTEM3種耐藥基因；5種耐藥基因結(jié)果顯示為不同程度的攜帶，其中tetC有19株呈陽(yáng)性，攜帶率為79.2%，cmlA有11株呈陽(yáng)性，攜帶率為45.8%，blaOXA有9株攜帶，攜帶率為37.5%，aadB有3株呈陽(yáng)性，攜帶率為12.5%，qnrA有1株呈陽(yáng)性，攜帶率為4.2%，具體陽(yáng)性株見(jiàn)表6。

2.6 梭菌毒素基因結(jié)果

PCR結(jié)果顯示，汶上蘆花雞源與SPF雞源的所有24株丁酸梭菌均不攜帶alpha、beta、epsilon、iota4種梭菌毒素基因中的任何一種，而從市場(chǎng)上某飼用菌粉中分離到的丁酸梭菌A1的alpha（α）毒素蛋白基因的PCR結(jié)果顯示為陽(yáng)性，且片段長(zhǎng)度符合目的條帶，如圖5所示。A1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后在Genbank中進(jìn)行BLAST，與α毒素蛋白基因同源性為99.43%。

2.7 肉毒毒素基因結(jié)果

PCR結(jié)果表明，24株分離得的丁酸梭菌不攜帶typeA、typeB、typeE、typeF4種肉毒毒素基因中的任何一種，typeE PCR結(jié)果見(jiàn)圖6。

3討論

本研究從汶上蘆花雞場(chǎng)與SPF雞場(chǎng)分得的丁酸梭菌在RCM固體培養(yǎng)基上呈現(xiàn)為大小不等的白色到黃白色、邊緣不規(guī)則菌落，這與目前研究中丁酸梭菌的菌落特征相符。16S rRNA鑒定結(jié)果與質(zhì)譜鑒定結(jié)果一致，表明質(zhì)譜與16S rRNA均可以快速準(zhǔn)確地完成丁酸梭菌鑒定。

16S rRNA測(cè)序結(jié)果表明，SPF雞場(chǎng)的3株丁酸梭菌之間差異較顯著，汶上蘆花雞場(chǎng)的21株丁酸梭菌之間的差異參差不齊，表明即使在同一雞場(chǎng)中，丁酸梭菌也會(huì)表現(xiàn)出差異。易至等2020發(fā)表的論文中采用比較基因組學(xué)的方法，發(fā)現(xiàn)宿主源和地理來(lái)源與丁酸梭菌的系統(tǒng)進(jìn)化沒(méi)有明顯的相關(guān)性；本研究基于16S rRNA序列對(duì)丁酸梭菌分離株的同源性分析結(jié)果顯示，宿主源和地理來(lái)源與丁酸梭菌的系統(tǒng)進(jìn)化無(wú)明顯相關(guān)性。二者結(jié)果相符。為進(jìn)行優(yōu)良菌株篩選提供更多具有個(gè)性的選擇。其中，L-17與KP944151.1相似性最高，為96.64%，樊曉璐等研究中丁酸梭菌與CP016332.1的梭菌屬菌株的相似性為100%，廖秀冬分離得丁酸梭菌相似性最高為99%。

本次試驗(yàn)中丁酸梭菌分離株在耐藥方面差異不大。3株SPF源丁酸梭菌對(duì)所有藥物均表現(xiàn)敏感；汶上蘆花雞場(chǎng)中僅4株菌株存在對(duì)2種抗生素的中介。易至等研究中受試菌株對(duì)萬(wàn)古霉素表現(xiàn)同樣為敏感，但對(duì)四環(huán)素表現(xiàn)出了抗性；高文文等研究中：丁酸梭菌對(duì)青霉素有抗性，對(duì)紅霉素中介，而此次分離得的丁酸梭菌對(duì)青霉素G和紅霉素均表現(xiàn)為敏感；在四環(huán)素、萬(wàn)古霉素結(jié)果相同為敏感。王騰浩等研究中，丁酸梭菌對(duì)新霉素有抗性，對(duì)青霉素、紅霉素、氧氟沙星表現(xiàn)為中介，本研究24株丁酸梭菌中，3株汶上蘆花雞源分離株對(duì)新霉素表現(xiàn)中介；對(duì)青霉素、紅霉素、氧氟沙星表現(xiàn)敏感；在萬(wàn)古霉素、四環(huán)素表現(xiàn)敏感。

KanekoN等人研究結(jié)果表明分得的丁酸梭菌對(duì)選用的20種抗生素中的17種不具有耐藥性。而FerrarisL等從早產(chǎn)兒糞便分得的丁酸梭菌對(duì)萬(wàn)古霉素與此次試驗(yàn)結(jié)果都表現(xiàn)為敏感，但其表現(xiàn)出青霉素G（15%）、四環(huán)素（7.5%）的耐藥。從藥敏試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，證實(shí)汶上蘆花雞不飼用抗生素，與本研究前期調(diào)查結(jié)果一致，SPF雞場(chǎng)也一定不使用抗生素。sul2、flor、blaTEM三種耐藥基因在菌株中攜帶率為100%。董睿從雞蛋源分離的沙門(mén)菌flor攜帶率為100%，試驗(yàn)結(jié)果與flor耐藥基因目前只發(fā)現(xiàn)存在于革蘭陰性菌不符；近些年多種細(xì)菌的sul2耐藥基因有較高攜帶率，李晴分離的大腸桿菌耐藥基因中blaTEM攜帶率為100%。5種不同程度攜帶的耐藥基因：tetC、cmlA、blaOXA、aadB、qnrA的來(lái)源以及是否會(huì)轉(zhuǎn)移有待研究，易至等就其研究中的四環(huán)素抗性結(jié)果提出丁酸梭菌可能攜帶有tet耐藥基因，而本研究耐藥基因檢測(cè)結(jié)果顯示tetC攜帶率為79.2%與其推論基本相符，但本研究中受試菌株對(duì)四環(huán)素未表現(xiàn)出耐藥。sul2、flor、blaTEM等3種耐藥基因，尤其flor是否能表達(dá)并發(fā)揮作用還需進(jìn)一步驗(yàn)證。目前由于丁酸梭菌作為益生菌的廣泛應(yīng)用，本研究揭示了，未來(lái)丁酸梭菌的篩選與使用上應(yīng)避免作為其成為耐藥基因的儲(chǔ)存庫(kù)，以減少有害菌獲得新耐藥基因的幾率。

本研究分離鑒定的24株丁酸梭菌均未發(fā)現(xiàn)攜帶alpha、beta、epsilon、iota等4種梭菌毒素基因，但發(fā)現(xiàn)市場(chǎng)上某飼用菌粉中分離得到的菌株A1中攜帶alpha毒素蛋白基因。SulthanaA等在健康人糞便中未分離到攜帶梭菌毒素的丁酸梭菌，IsaK等在對(duì)丁酸梭菌標(biāo)準(zhǔn)株CMB588的梭菌內(nèi)也未發(fā)現(xiàn)梭菌毒素基因。梭菌毒素基因的檢測(cè)結(jié)果初步表明本研究24株丁酸梭菌比市場(chǎng)上的部分產(chǎn)品具有更具安全性。

已有研究表明肉毒毒素基因可通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到梭菌中，目前針對(duì)丁酸梭菌攜帶毒素基因的研究也以肉毒毒素基因?yàn)橹鳌Ｈ舛径舅鼗蜩b定結(jié)果顯示，本研究24株丁酸梭菌均未攜帶肉毒毒素基因，這與GhoddusiHB等從土壤等多處分離得的93株丁酸梭菌中篩選攜帶E型肉毒毒素基因的研究結(jié)果一致（在93個(gè)被檢測(cè)的分離株中，均未發(fā)現(xiàn)typeE的存在）；本研究的24株分離株的肉毒毒素基因攜帶率為0%，表明不會(huì)產(chǎn)生typeA、typeB、typeE或typeF肉毒毒素，也進(jìn)一步驗(yàn)證了本研究24株丁酸梭菌的安全性。

4結(jié)論

結(jié)果表明，從未飼喂抗生素和丁酸梭菌的汶上蘆花雞與SPF雞獲得的24株丁酸梭菌分離株達(dá)到預(yù)期的安全性要求，可作為益生添加菌的篩選參考株。

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