１.１ 試驗材料

飼料桑粉由湖南省蠶桑科學研究所提供，經實驗室檢測營養成分含量為：粗蛋白質 ２２.９６％、粗脂肪 ６.２６％、粗纖維 ９.１８％、粗灰分 １３.９０％、鈣４.３７％和磷 ０.４６％。添加飼料桑粉的發酵試驗組采用全發酵方式（將不同比例的飼料桑粉添加至飼糧中后，對其進行發酵處理），將乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌按 ２∶１∶１ 的比例制成混合菌種，活菌數≥３×１０９ＣＦＵ／ｇ，進行固態發酵處理。發酵設備及試驗飼糧由湖南楚溈香農業有限公司提供。

１.２ 試驗設計

選取９０頭平均體重為３０ｋｇ 左右的寧鄉花豬，隨機分為５個組，每組３個重復（欄），每個重復 ６ 頭豬。對照組飼喂基礎飼糧，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組分別飼喂添加９％、１２％、１５％飼料桑粉的全發酵料和 ９％飼料桑粉的未發酵料。試驗于２０１６ 年７～９月在湖南寧鄉大龍畜牧科技有限公司豬場進行，試驗分為２個階段，中豬階段（試驗期第１～５０ 天）和大豬階段（試驗期第５１～７５天）。飼糧組成及營養水平見表１ 和表２。

１.３ 飼養管理與采樣

根據豬場常規程序進行飼養管理。預試期３ ｄ，自由采食、飲水。試驗期的第５０天，空腹１２ｈ后，各重復（欄）隨機選取 １ 頭試驗豬進行前腔靜脈采集血液（１０ ｍＬ×２），３０００ ｒ／ ｍｉｎ 離心 １０ ｍｉｎ后收集血清，－２０ ℃凍存待測；試驗期第７５天時，各重復（欄）隨機選取１頭試驗豬進行屠宰，采集血液制備血清待測。試驗結束后進行屠宰試驗，稱取０.１ｇ 左右肝臟組織樣品，加入９ 倍體積的生理鹽水后使用勻漿機制成 １０％的組織勻漿液，再將其在４ ℃下３０００ ｒ／ ｍｉｎ 離心１０ ｍｉｎ，取上清液待用；分離腸道，收集回腸食糜，封裝在 ５ ｍＬ 塑料離心管內，－８０ ℃ 凍存，用于回腸微生物測定；將十二指腸、空腸、回腸內容物清除干凈后，再用生理鹽水沖洗腸道，分別剪取各腸段２ｃｍ 置于甲醛固定液中，用于腸道組織形態測定。

１.４ 測定指標及方法

１.４.１ 血清抗氧化指標

測定 ２ 個階段（第 ５０ 天和第 ７５ 天）血清中丙二醛（ＭＤＡ）含量、總超氧化物歧化酶（Ｔ⁃ＳＯＤ）和谷胱甘肽過氧化物酶（ＧＳＨ⁃Ｐｘ）活性以及總抗氧化能力（Ｔ⁃ＡＯＣ）。測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，并按照試劑盒說明書進行指標測定。

１.４.２ 肝臟抗氧化指標

測定肝臟中 ＭＤＡ 含量、Ｔ⁃ＳＯＤ 和 ＧＳＨ⁃Ｐｘ 活性以及 Ｔ⁃ＡＯＣ。測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，并按照試劑盒說明書進行指標測定。

１.４.３ 腸道組織形態

制作腸道組織切片，觀察腸道組織結構，具體測量十二指腸、空腸、回腸的絨毛高度和隱窩深度，并計算絨毛高度與隱窩深度比（Ｖ／ Ｃ）。

１.４.４ 腸道菌群

利用糞便基因組 ＤＮＡ 提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司），按試劑盒說明書提取試驗豬回腸食糜 ＤＮＡ。對 ＤＮＡ 樣品進行檢測，檢測合格的樣品構建文庫委托華大基因完成，內容包括：回收目的 Ａｍｐｌｉｃｏｎ 片段，用 Ｔ４ ＤＮＡ 聚合酶、Ｋｌｅ⁃ｎｏｗ ＤＮＡ 聚合酶和 Ｔ４ 多核苷酸激酶（ＰＮＫ）將打斷形成的黏性末端修復成平末端，再通過 ３′端加堿基“Ａ”，使得 ＤＮＡ 片段能與 ３′端帶有“Ｔ”堿基的特殊接頭連接；或者設計合成含有測序接頭的雙 Ｉｎｄｅｘ 融合引物，以基因組 ＤＮＡ 為模板，進行融合引物 ＰＣＲ，磁珠篩選目的 Ａｍｐｌｉｃｏｎ 片段，最后，用合格的文庫進行 ｃｌｕｓｔｅｒ 制備和測序。數據經過數據過濾，濾除低質量的 ｒｅａｄｓ，剩余高質量的ｃｌｅａｎ ｄａｔａ 方可用于后期分析；通過 ｒｅａｄｓ 之間的ｏｖｅｒｌａｐ關系將 ｒｅａｄｓ 拼接成 Ｔａｇｓ；在給定的相似度下將 Ｔａｇｓ 聚成操作分類單位（ＯＴＵ），然后通過ＯＴＵ 與數據庫比對，對 ＯＴＵ 進行物種注釋；基于ＯＴＵ 和物種注釋結果進行樣品物種復雜度分析以及組間物種差異分析。

１.５ 數據處理與統計分析

采用 Ｅｘｃｅｌ ２００７ 和ＳＰＳＳ ２０.０ 軟件對數據進行整理，數據以平均值±標準差表示，所有組間進行方差分析，添加 ９％飼料桑粉全發酵料組與添加９％飼料桑粉未發酵料組進行 ｔ 檢驗，以 Ｐ＜０.０５ 作為差異顯著性判斷標準。

３.１ 發酵飼料桑粉對寧鄉花豬機體抗氧化性能的影響

由于寧鄉花豬特有的生理特點，其體脂含量相對較高，性質活潑的自由基可誘發體內不飽和脂肪酸的氧化，產生脂質過氧化反應，從而降低寧鄉花豬肉品質。血清及肝臟中 ＭＤＡ 含量、Ｔ⁃ＳＯＤ和 ＧＳＨ⁃Ｐｘ 活性以及 Ｔ⁃ＡＯＣ 反映了動物機體抗氧化防御系統的水平 。ＭＤＡ 是動物機體由于自由基的氧化作用產生過氧化脂質后分解代謝的產物，其含量越高說明動物機體產生的過氧化脂質越多，機體氧化損傷越嚴重；Ｔ⁃ＳＯＤ 是被稱為動物機體抗氧化系統的第 １ 道防線，可催化機體內超氧陰離子自由基（Ｏ２－•）生成過氧化氫（Ｈ２Ｏ２），Ｈ２Ｏ２進 而 與 過 氧 化 氫 酶 （ ＣＡＴ） 反 應 生 成 水（Ｈ２Ｏ）和氧氣（Ｏ２ ），是機體清除自由基的首要物質；ＧＳＨ⁃Ｐｘ 是動物機體內一種具有催化過氧化物分解的酶，可以特異性的催化還原谷胱甘肽，從而使得谷胱甘肽與動物機體內的氫過氧化物發生還原反應，降低機體氧化損傷；Ｔ⁃ＡＯＣ 是動物機體抗氧化系統功能狀態的一個綜合性指標，反映了動物機體抗氧化系統的總體水平。章丹丹等研究發現，在桑枝中提取的黃酮化合物在細胞試驗和體外化學試驗匯總均具有抗氧化活性，有很強的自由基清除能力。周林從桑枝中分離提純出黃酮類化合物，通過體外模擬試驗同樣證明桑枝中黃酮類化合物具有抗氧化活性。本試驗研究發現利用飼料桑粉飼喂寧鄉花豬可有效提高其血清中Ｔ⁃ＡＯＣ，且添加 １５％ 飼料桑粉全發酵料組血清Ｔ⁃ＡＯＣ顯著高于對照組，這與黃靜等利用桑葉粉飼喂胡須雞研究結果相似，這可能與飼料桑粉中所含的黃酮類具有的抗氧化活性有關。陳玲玲等研究桑葉黃酮對糖尿病小鼠的影響中發現，桑葉黃酮可有效提高小鼠肝臟中超氧化物歧化酶活性，降低肝臟中 ＭＤＡ 含量。本試驗研究發現，飼料桑粉添加組寧鄉花豬肝臟 ＭＤＡ 含量相比對照組有降低的趨勢，肝臟中 Ｔ⁃ＳＯＤ、ＧＳＨ⁃Ｐｘ 活性和 Ｔ⁃ＡＯＣ 相比對照組均有所提高，說明飼料桑粉可以有效提高寧鄉花豬機體抗氧化水平，進而改善肉品質。

３.２ 發酵飼料桑粉對寧鄉花豬腸道組織形態的影響

小腸是動物機體消化吸收營養物質的主要部位，絨毛高度、隱窩深度及 Ｖ／ Ｃ 值是反映小腸消化吸收功能的重要指標。小腸黏膜上有大量腸絨毛，絨毛高度越高則小腸對營養物質的吸收面積越大，消化吸收功能越強，絨毛萎縮引起絨毛高度的降低將導致小腸吸收功能的下降；隱窩深度的高低反映了腸上皮細胞的生成率，腸道隱窩的細胞不斷的向絨毛處分化，替代補充脫落或損傷的絨毛細胞，隱窩處細胞生成率下降將使隱窩深度變淺，表明絨毛細胞成熟率上升，小腸營養吸收功能增強。有研究表明，隱窩深度還反映了腸上皮細胞的遷移率，隱窩深度降低則表明動物腸上皮細胞的遷移率降低，動物腸上皮細胞的遷移率降低可以減少能量損失，從而有利于促進動物生產性能。小腸 Ｖ／ Ｃ 值可以比較直觀地反映小腸的消化吸收能力，Ｖ／ Ｃ 值越高則代表小腸消化吸收能力越強。本試驗研究發現，飼料桑粉添加組寧鄉花豬空腸絨毛高度及 Ｖ／ Ｃ 值相比對照組有所下降，這可能與飼料桑粉中所含的單寧及植物凝集素等抗營養因子損傷腸道上皮細胞有關，具體原因有待進一步研究；添加 ９％飼料桑粉全發酵料組相比添加 ９％飼料桑粉未發酵料組寧鄉花豬空腸和回腸 Ｖ／ Ｃ 值顯著提高，且在本課題組前期試驗結果表明添加 ９％飼料桑粉全發酵料對寧鄉花豬生長性能有一定的改善作用，說明發酵工藝可通過降低或清除飼料桑粉中的抗營養因子，從而降低飼料桑粉對寧鄉花豬腸道的損傷，進而有益于其生產性能。

３.３ 發酵飼料桑粉對寧鄉花豬腸道菌群的影響

動物腸道菌群的穩態與宿主的腸道健康狀況及生產性能密切相關，腸道菌群的變化也可直接影響 動 物 腸 道 對 營 養 物 質 的 吸 收 代 謝。Ｌａｍｅｎｄｅｌｌａ等研究表明，豬腸道內的微生物中的厚壁菌門和擬桿菌門與機體對碳水化合物的代謝有一定相關。 本試驗研究發現，門水平上，厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門這 ３ 種門類的微生物占回腸菌群的 ９５％以上；所有寧鄉花豬回腸菌群共產生 ２５７ 個 ＯＴＵ，腸道菌群相對豐度越高則越有利于維持動物腸道菌群的穩態，進而促進動物生產性能。 呂月琴等和舒剛等利用發酵飼料分別在蛋雞和肉雞飼養試驗中發現，飼喂發酵飼料組相比未發酵飼料組，動物腸道中的乳酸菌等益生菌數量顯著提高，大腸桿菌數量有效降低。Ｃａｎｉｂｅ 等利用發酵飼料和未發酵飼料飼喂生長試驗發現，發酵飼料可有效提高動物腸道有益菌數量，有利于促進動物腸道菌群的穩態并提高菌群豐度。 本試驗研究表明，全發酵料組寧鄉花豬回腸菌群 Ａｌｐｈａ 多樣性指數相比未發酵料組，ＯＴＵ 和 Ｃｈａｏ 指數有所提高，且各全發酵料組相比未發酵料組乳桿菌種的相對豐度更高，這可能與添加飼料桑粉飼糧經發酵處理后，飼糧 ｐＨ 降低，飼喂寧鄉花豬后在腸道中提供了一個適合乳酸菌等喜酸益生菌種的大量繁殖的環境有關，此結果與鄺哲師等利用發酵桑葉粉飼喂胡須雞試驗結果相似，具體原因有待進一步研究。