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導讀

從20世紀中葉研究起始至今，短短60年時間，飼用酶制劑先后經歷了從以助消化為目的第一代飼用酶制劑、以降解簡單抗營養因子為目的第二代飼用酶制劑，向以降解復雜抗營養因子或毒物為目的第三代飼用酶制劑的跨越（馮定遠，2012）。第一代飼料酶制劑，由于其主要目的是補充體內“消化酶”，一般也稱為“外源性營養消化酶”，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、乳糖酶、肽酶等；第二代飼料酶制劑則以降解“單一組分抗營養因子或毒物”為目的，如木聚糖酶、β- 葡聚糖酶、纖維素酶、黃曲霉毒素脫毒酶類等，這類酶以非淀粉多糖酶為主，主要是水解酶類，而黃曲霉毒素脫毒酶是分解酶類；以降解“多組分抗營養因子”為目的的酶制劑，如α- 半乳糖苷酶、β- 甘露聚糖酶、果膠酶、殼聚糖酶、木質素過氧化物酶，我們可稱之為“第三代飼料酶制劑”。

當前，飼料酶制劑的研究和技術發展迅速，在飼料中的應用也越來越廣泛，但是目前飼料酶制劑開發和應用中仍然存在許多問題。酶制劑在畜禽日糧中的應用還有不少的爭議，而且這些問題和爭議將會很長時間存在。不少的飼料酶制劑產品達不到作為飼料添加劑的要求，產品設計的盲目性還比較普遍。但不可否認，酶制劑是最有發展前景的飼料添加劑之一，作為一類具有生物學活性的飼料添加劑產品，天然、綠色、安全、高效是其本身的特性，決定了其使用具有廣闊的前景。飼料酶制劑比其他酶制劑更加復雜，問題更突出，其中對酶制劑的功能、特性、作用，特別是如何與動物的生理特性結合起來，如何使其價值的量化，如何營養化等等，將是飼料酶制劑急需解決的問題，也是將來研究的重點。

影響酶制劑在飼料中應用的因素很多，既有酶本身的因素、動物對象的因素，也有日糧構成及其加工的因素，還有綜合的因素等。本文將針對理想飼料酶制劑的一些特性以及如何根據動物生理特點、飼料加工等因素改進酶制劑的特性進行論述，并提出一些改進思路和設計方案。

1酶制劑的生物不穩定性

酶的本質是蛋白質，它與所有其他的飼料蛋白質一樣，對動物胃酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶和飼料加工處理非常敏感。飼料蛋白質是以氨基酸為單位而發揮作用的，所以無需維持構型，而飼料酶制劑如果不能夠耐受動物胃內的酸性環境、不能夠抵抗胃蛋白酶和胰蛋白酶的消化、不能夠耐受飼料加工過程中的高溫高濕條件，則其構型就會發生改變甚至被破壞，以致發生不可逆轉的變性，而失去活性不再發揮作用。

從自然界中篩選的不同微生物基因所表達的酶制劑，其生物敏感性也有比較大的差異。Pettersson 等（1997）研究證實，由高溫霉菌（Thermomyces）、腐質霉（Humicola）和木霉（Trichoderma）分離到的木聚糖酶在熱穩定性上也存在差異。由木霉分離到的木聚糖酶在75℃調質溫度下明顯失活；而由高溫霉與腐質霉分離到的木聚糖酶在85℃調質溫度下可保留80%以上的活性。其中由高溫霉菌分離到的木聚糖酶，即使在95℃的調質溫度下仍可保留70%以上的活性。

所以，作為飼料用酶制劑，一方面我們要篩選特性好、對底物降解能力強的酶制劑，同時還要篩選的酶制劑盡可能耐受胃酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶和飼料加工制粒時的高溫、高濕條件。當然，我們除了從自然界中篩選具備這些抗逆特性的酶制劑基因外，隨著生物技術的不斷進步，我們還可以對一些特性好的酶制劑基因進行針對性的抗逆特性改造。比如，我們可以通過基因突變選育或基因工程改造的手段，使由木霉分離到的木聚糖酶對飼料制粒調質溫度的耐受性從75℃提高到85℃，即在85℃調質溫度下可保留90%以上的活性。同樣，我們也可以通過基因突變選育或基因工程改造的手段，獲得能夠耐受胃酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶的飼料酶制劑。

里氏木霉

2酶制劑的種類和來源的多樣性

目前，用于飼料酶制劑的種類和來源非常多，如何選擇適用于各種復雜的飼料原料和飼料配方以及不同的動物品種和生理階段的酶制劑，這也是飼料酶制劑行業面臨的一個重大課題。

以最常用的木聚糖酶和植酸酶為例，木聚糖酶由細菌和真菌產生，此類微生物包括：需氧性微生物（aerobes）、厭氧性微生物（anaerobes）、嗜溫微生物（mesophiles）、嗜熱微生物（thermophiles）和極端微生物（extremophiles）。通常，木聚糖酶對多聚木聚糖的內部β-1,4鍵有活性，這種木聚糖酶稱為內切木聚糖酶。根據其對不同多糖的活性，內切木聚糖酶又可分為特異性和非特異性木聚糖酶（Coughlan，1992、1993）。特異性內切木聚糖酶僅對木聚糖的β-1,4鍵有活性，而非特異性內切木聚糖酶可以水解以β-1,4鍵連接的木聚糖、混合木聚糖的β-1,4鍵及其它糖類β-1,4鍵連接的多糖。

很多種微生物能夠產生對植酸具有水解作用的酶類，Dvorakova（1998）列出了29種已知的能夠產生植酸酶活性的真菌、細菌、酵母。所列的這29種微生物中，21種產生的是細胞外植酸酶，如細絲狀真菌——黑曲霉（Aspergillus niger）能產生一種高活性的細胞外植酸酶等（Volfova等，1994）。植酸酶可以被分成6-植酸酶和3-植酸酶。這種分類是根據植酸分子水解的起始位點而劃分的， 6-植酸酶多來源于植物，而3-植酸酶是由霉菌（Aspergillussp.）產生的。

我們在選擇飼料酶制劑的時候，就要根據飼料原料中的抗營養因子特性來選擇相應種類和來源的酶制劑。另外，為了提高酶制劑的降解效率并適應復雜的飼料原料和配方，我們還可以選擇多種來源的作用于同一底物的酶制劑進行組合，即目前已經在飼料酶制劑行業中使用的組合酶技術。比如我們可以選擇高效降解玉米木聚糖的木聚糖酶和高效降解小麥木聚糖的木聚糖酶進行組合，用于目前常用的玉米-小麥日糧；選擇酸性木聚糖酶和中性木聚糖酶進行組合，以擴大木聚糖酶的作用pH范圍，適應動物胃中偏酸性的環境和腸道的中性環境。

3動物種類和生理階段的差異性

目前，單胃動物日糧中使用酶制劑已迅速得到普及和推廣，酶制劑在單胃動物體內的作用機制和作用模式也已經建立。酶制劑在反芻動物日糧中添加對其生產性能有改善作用，但是結果并不完全一致，瘤胃消化道的特點（如有很多微生物菌落，能產生很多內源性酶制劑） 使得外源酶制劑在反當動物體內的作用機制更加復雜（McAllister等，2001）。同樣是單胃動物，豬和家禽也是有差別的，豬和家禽對日糧中添加外源性碳水化合物酶反應不同的原因可能由生理解剖結構不同引起的（Chesson，1993；Dierick等，1994、1996）。與家禽相比，影響豬對酶制劑潛在反應的主要因素有：胃腸道解剖結構、消化能力以及食糜的特征等（Partridge，2001）。不同種類和來源的酶制劑的最佳pH值不同，肉仔雞嗉囊的存在，使得一些酶在進人pH值低的肌胃之前，首先在相對高的pH值環境（pH值約為6.0）中發揮活性。而對于豬來講，在胃的pH值更低的環境中（pH值小于3），酶制劑會迅速與其底物接觸，而潛在地影響到外源性酶的活性。另外，家禽的固態和液態食糜的平均保留時間比豬少（Moran，1982），所以這兩種動物對外源性酶制劑的需要及相對重要性也有差異。

幼齡動物的消化生理明顯與成年動物不同，酶制劑的作用差別更大。用外源酶對豆粕進行預處理，這對幼齡動物特別是對早期斷奶仔豬似乎有重要意義（Hessing等，1996；Rooke等，1998），而用酶制劑預處理的大豆粕對生長育肥豬似乎不特別重要。

根據不同的動物種類和生理特點來選擇飼料酶制劑尤為重要。比如，乳仔豬處于生長發育的初級階段，體內各種內源酶的分泌機能還不夠成熟，同時喂給乳仔豬的飼料中通常含有較高的動物源性蛋白質、脂肪等，而含有較少的高水平抗營養因子的植物性原料，故乳仔豬日糧中酶制劑的選擇應以酸性蛋白酶、中性蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等為主，以補充內源酶分泌不足，而非淀粉多糖酶類應作為輔助酶制劑使用。反芻動物飼料酶制劑的作用部位主要在瘤胃，由于瘤胃內特殊的消化環境（pH6.5左右的偏中性環境，大量的微生物群系，多種內源酶的作用），外源酶制劑在瘤胃中作用受到很多因素的影響，造成了外源酶制劑在反芻動物中使用的效果不確定性。但以瘤胃真菌基因所表達的中性纖維素酶和以瘤胃產甲烷菌基因表達的中性木聚糖酶（湖南尤特爾生化有限公司奶牛專用復合酶）在產奶牛日糧中的應用，取得了顯著的效果，奶牛的產奶性能和乳脂產量有明顯的提升（任慧波等，2013；徐曉明等，2014）。

4谷物中天然抑制因子對酶制劑的抑制作用

Debyser等（1997）在研究用大麥芽和未發芽小麥釀造過程中阿拉伯木聚糖的增溶作用時，首次證明了小麥中含有蛋白類木聚糖酶抑制劑。近年來在一些谷物（如小麥、黑麥、硬粒小麥、大麥、水稻和玉米）中已發現三種不同類型的木聚糖酶抑制劑，分別為TAXI 型、XIP型和TLXI 型。這些谷物中存在的抑制木聚糖酶活性的蛋白質，降低了木聚糖酶在動物生產中的應用效果。

Gebruers等（2001）用Bacillus subtilis 木聚糖酶和Aspergillus niger木聚糖酶作為純化過程中抑制活性測定的實驗酶，從小麥中得到了兩種具有不同抑制活性的TAXI 亞型：TAXI-I 和TAXI-II。其中，TAXI-I 為非糖基化的堿性單體蛋白，分子量大約為40 kDa； TAXI-II 為非糖基化的二聚體蛋白，兩個亞單位分子量分別為30 kDa 和10 kDa。

XIP型木聚糖酶抑制劑 XIP-I 是一種糖基化的堿性單體蛋白，pI 約為8.8，分子量為29 kDa，擁有一個獨特的N-末端序列(AGGKTGQVTVFWGRN)，該抑制劑的糖基化水平約為2%(w /w)，與近年來鑒定的有兩個N-糖基化位點的 XIP-I 的X-射線衍射結構相吻合。通過陽離子交換層析(CEC)和疏水色譜(HIC)的方法首先從小麥中分離出 XIP 型抑制劑，并用黑曲霉木聚糖酶作為其純化的實驗酶（McLauchlan W R，Garcia-Conesa M T，Williamson G.等，1999）。從其他一些谷物，如黑麥、硬粒小麥、大麥及玉米中純化得到的XIP-I，其分子特性及N-末端氨基酸序列與小麥XIP-I 高度相似，都是堿性單體蛋白。其中，黑麥和硬粒小麥 XIP 的pI 為8.0～8.5，大麥XIP 的 pI 為8.1～9.0，玉米 XIP 的 pI 為7.0～7.5 (Goesaert H，Gebruers K，Brijs K等，2011)。通過高分辨率的陽離子交換及等電聚焦，已經從不同谷物中檢測到至少5種亞型的XIP-I（Gebruers K，Goesaert H，Brijs K 等，2002）。

Fierens等（2007）發現，谷物中除了 TAXI 型和 XIP 型木聚糖酶抑制劑之外，還存在第三種在結構上完全不同于前兩種的木聚糖酶抑制劑———TLXI ( Thaumatinlike xylanase inhibitor)型。TLXI首先在小麥中被發現，與類甜蛋白( TLPs) 的同源相似性達60%以上，且具有類甜蛋白典型的特征。因此，TLXI 型抑制劑被劃分到類甜蛋白家族，與該家族的 TLP3 同源性最高。

通常來說，同一種木聚糖酶抑制劑對不同來源的木聚糖酶抑制程度有所區別。TAXI 型抑制劑作用于 GH11 家族細菌和真菌來源的木聚糖酶，而對 GH10 家族真菌木聚糖酶則沒有抑制作用（Gebruers K，Debyser W，Goesaert H 等，2001）。除棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus，GH10) 木聚糖酶及厭氧真菌(如 Neocallimastix，GH11)來源的木聚糖酶外， XIP 型抑制劑 XIP-I 對 GH10 和GH11 家族的真菌木聚糖酶有抑制作用，而對 GH10 和GH11 家族的細菌木聚糖酶沒有抑制作用(Flman R，McLauchlan W R，Juge N 等，2002)。TLXI 能非競爭性抑制大部分 G/11 家族的木聚糖酶，但不抑制 GH10 和高等電點的GH11 木聚糖酶。例如: G/11 家族高等電點的長枝木霉木聚糖酶II( pI9.0)、枯草芽孢桿菌木聚糖酶對 TLXI 不敏感。實驗證實野生 TLXI 和重組 TLXI 均為慢的緊束縛型抑制劑，而 TAXI 和 XIP則屬于競爭型的抑制劑（Fierens E，Rombouts S，Gebruers K 等，2007）。

谷物中木聚糖酶抑制劑的存在大大降低了木聚糖酶的使用效果，不僅增加了動物生產中的飼料成本，而且造成嚴重的資源浪費與環境污染。隨著分子生物技術的發展和對木聚糖酶抑制劑研究的逐漸深入，弄清木聚糖酶抑制劑與不同來源木聚糖酶的作用機理，并進一步篩選出對抑制劑敏感度較低(具有良好抗逆性)的木聚糖酶，不僅是推動畜牧生產、提高經濟效益的有效途徑，同時也是響應低碳減排、實現可持續發展的重要舉措。相關的研究已經取得較大進展， 第一是篩選出對抑制劑敏感度較低的木聚糖酶的天然菌株；第二是對木聚糖酶分子進行人工改良，以降低木聚糖酶對抑制劑的敏感度，最終獲得對抑制劑敏感度極低的木聚糖酶及其工程菌株。

5日糧營養水平與酶作用提供可利用營養的比較性

從理論上講, 不管是直接提高營養成分消化率的酶制劑（如蛋白酶、淀粉酶等）,還是間接提高飼料營養消化利用的酶制劑（如木聚糖酶、葡聚糖酶等）,都不同程度提高了動物消化道總的有效營養供應量，這與沒有添加酶制劑的情況不同。在實踐應用中，如果按照原來的營養參數設計日糧配方，營養水平已經偏高的情況下，供給有效營養總量已經足夠，再使用酶制劑的意義就不大，生產中也有可能顯示不出效果。營養水平較高的玉米-豆粕型日糧中添加酶制劑沒有明顯效果（Charlton，1996），在 Borja vila（1999）的試驗中，當日糧中的大豆粕含量增加到60%時，其代謝能和未加酶組相比無差異。該結果與 Leske 等（1993）的報道一致，這說明有必要調整飼養標準。在某些情況下，使用了酶制劑以后，動物的采食量反而下降（不少情況是提高采食量），一種解釋是使用酶制劑提高了可利用（有效）營養的供應，特別是可消化能或代謝能，有時候動物能夠根據營養水平（如代謝能水平）調節采食量，相應地動物將減少飼料的攝人量。

目前在飼料酶制劑的精確使用和加酶日糧的飼養標準方面，不少酶制劑生產廠商和科研機構都投入了大量的人力物力進行研究，也取得了不少創新性成果。其中，加酶日糧ENIV（有效營養改進值）系統的建立和應用，給酶制劑的精確使用指明了方向，但由于不同來源的酶制劑即使針對同一種原料的降解效果也存在很大差異，故不同酶制劑生產廠家顯然無法建立統一的飼料原料或日糧配方的ENIV值數據庫供客戶使用。這就要求酶制劑生產廠家必須針對自己的酶制劑（單酶或復合酶）建立常用飼料原料的ENIV值數據庫供客戶制作日糧配方時參考，這對酶制劑生產廠家來講確實是一項投資巨大、耗時耗力，但意義重大的工程。

6酶制劑在畜禽飼料中應用功能的多元性

酶制劑在飼料中的應用功能有許多方面，其中營養功能是最主要的。但是，某些酶制劑并不表現營養的功能，反映在一般的生產性能方面的效果可能不明顯。傳統上，人們討論酶制劑在畜禽日糧中使用的效果時，一般是考慮動物的生產性能，特別是日增重和飼料報酬。酶制劑在畜禽飼料中應用大部分也是改善動物傳統意義上的生產性能，但是部分酶制劑的功能并不表現在典型的生產性能提高，而有可能是其他性能，或者是廣義上的生產性能，例如外觀表現、健康狀況、整齊度、成活率、同期出欄的比例等等，廣義上的生產性能同樣也影響飼養的效益。這些狹義上的生產性能（或者傳統意義上的生產性能）以外的其他動物生產性能指標稱為“非常規動物的生產性能指標”（馮定遠等，2011）。由于酶制劑的復雜性及其功能的多元性，有些時候，應用“非常規動物生產性能指標”評定飼料酶制劑的作用效果更有意義。

隨著畜牧養殖業的快速發展和飼養水平的不斷提高，人們對飼用酶制劑的特性和功能的要求也越來越高，理想的飼用酶制劑將是未來飼料酶制劑發展的方向和追求的目標。我相信，隨著生物技術的快速發展和酶制劑應用技術研究的不斷深入，理想的飼用酶制劑離我們越來越近，也會源源不斷地應用到我們的畜牧養殖和飼料生產中，為提高畜牧養殖的水平和飼料工業的效益發揮不可磨滅的作用。