添加菌酶復合制劑發(fā)酵玉米秸稈的試驗

2020-06-17 09:21:02 點擊：

摘要：本試驗旨在探究菌酶復合制劑發(fā)酵玉米秸稈的最佳發(fā)酵條件及發(fā)酵效果。運用均勻設計試驗，以中性洗滌纖維降解率、酸性洗滌纖維降解率為目的指標，對黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)接種量、纖維素酶和木聚糖酶添加量及發(fā)酵天數4個因素進行篩選，并對發(fā)酵效果進行評價和比較分析。結果表明:菌酶復合制劑發(fā)酵玉米秸稈的干物質、粗蛋白質含量顯著高于未發(fā)酵秸稈(P＜0.05)，酸性洗滌木質素、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維含量顯著低于未發(fā)酵秸稈(P＜0.05)。本研究所獲得的最佳發(fā)酵條件為:纖維素酶添加量0.2g/kg，木聚糖酶添加量0.1g/kg，黃孢原毛平革菌接種量20%，發(fā)酵天數19d;在此條件下，玉米秸稈的中性洗滌纖維降解率和酸性洗滌纖維降解率分別達到了23.47%和20.13%。

近年來，隨著我國農業(yè)生產技術水平的不斷提高，糧食產量逐年攀升，導致農作物秸稈的數量也在不斷增加。有效利用農作物秸稈作為飼料資源不僅可緩解人畜爭糧這一矛盾，還可以降低秸稈處理的成本并減少焚燒處理帶來的環(huán)境污染。然而秸稈細胞壁結構復雜，難以被動物消化吸收，從而造成秸稈的堆積浪費。玉米秸稈由細胞壁中的木質素和半纖維素相互交聯并將纖維素鑲嵌于內，以牢固的醚鍵或酯鍵連接;同時，木質素又包圍著纖維素形成一種外圍基質，致使微生物和酶對半纖維素、纖維素的降解受到限制，而且動物體內又缺乏降解木質素的酶，導致家畜對玉米秸稈的利用率較低。通過黃貯，既可降低秸稈的纖維組分含量，又可改善發(fā)酵品質，還有利于長期保存。馮沖凌在堆肥中接入黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)，其木質素降解率較對照組提高了10.9%;Zhi等通過試驗對小麥秸稈在30℃條件下固態(tài)發(fā)酵12d，其木質素降解率達到(28.5±1.3)%，使木質纖維素結構明顯破壞;Chen等在玉米秸稈和低芥酸菜籽殘渣中接種黃孢原毛平革菌，結果表明，其纖維素和木質素含量分別降低了40.0%和64.3%。國內外有關秸稈黃貯的研究多集中在乳酸菌及產纖維素酶細菌等方面，但如果不解決木質素的問題，其纖維素酶的降解作用也會受到影響。黃孢原毛平革菌是白腐真菌的一種，其分泌的錳過氧化物酶、漆酶、木質素過氧化物酶等胞外酶可有效降解秸稈中的木質素，使原本被木質素包裹的纖維素、半纖維素釋放出來。而纖維素酶、木聚糖酶可直接或間接通過物理或化學的作用使秸稈整個纖維結構得到膨脹和破壞。因此，本研究擬使用菌酶復合制劑對玉米秸稈進行混合發(fā)酵，探討其最佳發(fā)酵條件，以期為提高玉米秸稈的飼用價值提供理論依據。

1材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種和酶制劑

黃孢原毛平革菌CICC40299購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，活菌數為1×108CFU/mL;纖維素酶活性≥10000U/g;木聚糖酶活性≥30000U/g。

1.1.2 玉米秸稈

玉米秸稈購自大慶市周邊農戶，在自然風干后，用粉碎機切至1～2cm。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng):馬鈴薯浸粉3g，葡萄糖20g，瓊脂14g。黃孢原毛平革菌液體種子培養(yǎng)基:馬鈴薯提取液1L，葡萄糖20g，KH2PO43g，MgSO4·7H2O1.5g，維生素B1微量。121℃滅菌15min。

1.1.4 菌種培養(yǎng)

菌種活化:將黃孢原毛平革菌凍干菌粉接種到PDA培養(yǎng)基上，在28℃條件下培養(yǎng)5d，并轉接活化2次，放于4℃保存?zhèn)溆?。液體菌種培養(yǎng):將PDA培養(yǎng)基上的黃孢原毛平革菌接種到黃孢原毛平革菌液體種子培養(yǎng)基中，于28℃、150r/min條件下振蕩培養(yǎng)7d。

1.2 試驗方法

1.2.1 發(fā)酵條件的篩選

在固態(tài)發(fā)酵條件下，通過均勻設計對纖維素酶和木聚糖酶添加量、黃孢原毛平革菌接種量以及發(fā)酵天數進行篩選試驗，水分含量調節(jié)至60%～65%。均勻設計因素水平見表1。

1.2.2 發(fā)酵條件的驗證

將切短至1～2cm的玉米秸稈按均勻設計篩選的最佳發(fā)酵條件，添加菌酶復合制劑，并將水分含量調節(jié)至60%～65%，裝入33cm×40cm聚乙烯袋內，每袋1kg，用真空包裝機(AT－620)抽真空并封口，室溫下(25～32℃)發(fā)酵19d。發(fā)酵驗證試驗設置3個重復，開封后用于樣品測定。

1.3 指標測定

1.3.1 常規(guī)營養(yǎng)成分含量的測定

酸性洗滌木質素(ADL)、中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量參考范氏洗滌纖維分析法測定。常規(guī)營養(yǎng)成分含量參照《飼料分析及飼料質量檢測技術》測定。試驗中中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維降解率按以下公式計算:

中性洗滌纖維降解率(%)=100×［m2－(m1×c1)］/m;

酸性洗滌纖維降解率(%)=100×［m2－(m1×c1)］/m。

式中:m1為空袋質量;m為樣品質量;m2為提取處理后樣品殘渣+濾袋質量;c1為空白袋子校正系數(烘干后質量/原來質量)。

1.3.2 發(fā)酵秸稈感官評定

開封后立即稱取發(fā)酵秸稈樣品20g，加入180mL蒸餾水，用均質器拍打90s使其充分混勻，再進行過濾，濾液用于測定飼料pH及有機酸。按青貯飼料質量評定標準進行感官評定，分別從氣味、色澤、質地、含水率、pH進行綜合評定。100分分配:pH為25分，含水量為20分，色澤為20分，氣味為25分，質地為10分。75～100分為優(yōu)等，51～76分為良好，26～50為一般，25分及以下為劣質。

1.3.3 有機酸和氨態(tài)氮(NH3-N)濃度的測定

有機酸濃度采用安捷倫1200型高效液相色譜儀測定:有機酸專用色譜柱300mm×7.8mm，折光檢測器，柱溫為55℃，壓力為32bar，流速為0.55mL/min;流動相為0.1%硫酸水溶液。取經低速離心后的秸稈濾液5mL加25%的偏磷酸1mL混勻，取混合液體1mL在4℃、12000r/min離心15min，將上清液用0.22μm水膜緩慢過濾后，即刻用注樣器上機測定有機酸濃度，上樣量為5μL，通過外標法計算。氨態(tài)氮濃度參照馮宗慈等的方法測定。

1.4 數據處理

試驗數據使用Excel 2016軟件整理，采用DPS V7.05軟件的均勻設計模塊對數據進行多元二次逐步回歸分析。最佳發(fā)酵條件驗證試驗運用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件的獨立樣本t檢驗方法，試驗數據用平均值±標準誤表示。

2結果與分析

2.1 回歸方程的建立

中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維降解情況見表2。以纖維素酶(X1)、木聚糖酶(X2)、黃孢原毛平革菌(X3)、發(fā)酵天數(X4)作為自變量，以中性洗滌纖維降解率(Y1)、酸性洗滌纖維降解率(Y2)作為因變量，利用多元二次逐步回歸建立回歸方程。

中性洗滌纖維降解率的回歸方程:

Y1=7.2729－8.5804X1+0.9266X4－0.2567X2X3。

式中:Y1為中性洗滌纖維降解率(%);X1為纖維素酶添加量(g/kg);X2為木聚糖酶添加量(g/kg);X3為黃孢原毛平革菌接種量(%);X4為發(fā)酵天數(d)。

經優(yōu)化后的發(fā)酵條件分別為X1=0.20、X2=0.12、X3=20、X4=19.07，在優(yōu)化條件下預測中性洗滌纖維降解率為22.59%。

酸性洗滌纖維降解率的回歸方程:

Y2=5.7763－8.9204X1+0.9126X4－0.2389X2X3。

式中:Y2為酸性洗滌纖維降解率(%);X1為纖維素酶添加量(g/kg);X2為木聚糖酶添加量(g/kg);X3為黃孢原毛平革菌接種量(%);X4為發(fā)酵天數(d)。經優(yōu)化后的發(fā)酵條件分別為X1=0.20、X2=0.13、X3=20.01、X4=19.24，在優(yōu)化條件下預測酸性洗滌纖維降解率為20.80%。

由表3可知，F1，F2＞F24=6.94(a=0.05)，P＜0.05，回歸方程具有顯著意義。理論最佳發(fā)酵條件為:纖維素酶添加量0.2g/kg，木聚糖酶添加量0.1g/kg，黃孢原毛平革菌接種量20%，發(fā)酵天數19d。

2.2 最佳發(fā)酵條件驗證

為了驗證試驗模型的準確性，在上述優(yōu)化條件下進行發(fā)酵結果驗證。并繼續(xù)探究菌酶復合制劑發(fā)酵秸稈的發(fā)酵品質。采用上述最佳發(fā)酵條件，實際測得觀測值如表4所示。菌酶復合制劑發(fā)酵秸稈的粗蛋白質、干物質含量分別較未發(fā)酵秸稈提高了60.00%和3.75%(P＜0.05)，酸性洗滌木質素含量較未發(fā)酵秸稈降低了6.95%(P＜0.05);菌酶復合制劑發(fā)酵秸稈的中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維含量分別較未發(fā)酵秸稈降低了23.47%、20.13%(P＜0.05)，與預測值(22.59%和22.80%)差距不大，試驗相對誤差分別為3.91%、3.22%，相對誤差較小，可以較好地反映發(fā)酵效果，為以后大規(guī)模發(fā)酵提供理論依據。

2.3 發(fā)酵品質的驗證

由表5可知，菌酶復合制劑發(fā)酵秸稈pH顯著低于未發(fā)酵秸稈(P＜0.05)，表明添加菌酶制劑可有效降低發(fā)酵物的pH;在色澤、氣味、質地感官評價方面，發(fā)酵秸稈品質明顯優(yōu)于未發(fā)酵秸稈，接近優(yōu)質發(fā)酵。

2.4 有機酸和氨態(tài)氮含量

由表6可知，菌酶復合制劑發(fā)酵秸稈，乳酸含量顯著高于未發(fā)酵秸稈(P＜0.05)，氨態(tài)氮含量顯著低于未發(fā)酵秸稈(P＜0.05)，乙酸、丙酸含量差異不顯著(P＞0.05)，丁酸未檢出。

3討論

均勻設計法只考慮試驗點在試驗范圍內均勻分布，與正交試驗相比，可大大減少試驗次數，從而節(jié)約時間、節(jié)約資源，適合用來優(yōu)化工藝篩選條件。本試驗采用均勻設計法對菌酶復合制劑的最優(yōu)發(fā)酵條件進行試驗，通過逐步回歸分析得到菌酶復合制劑的最佳組合，經驗證試驗得到的中性洗滌纖維降解率、酸性洗滌纖維降解率與預測值相符。

發(fā)酵飼料成功的關鍵在于提供適宜的條件。為創(chuàng)造厭氧環(huán)境要把原料壓實，而水分含量過低，不易壓實，所以一般將發(fā)酵飼料適宜的水分含量調整為65%～70%。本試驗通過黃孢原毛平革菌固體發(fā)酵所產生的3種酶系破壞木質素的復雜結構，酸性洗滌木質素含量降低6.95%，可釋放出纖維素和半纖維素，再利用酶制劑的高效性對纖維素和半纖維素進行降解，以期提高玉米秸稈的營養(yǎng)價值。發(fā)酵結束后玉米秸稈的感官評定和營養(yǎng)成分含量的變化表明，添加菌酶復合制劑可以顯著提高發(fā)酵飼料的品質。與未發(fā)酵秸稈相比，發(fā)酵后秸稈均具有酸香味、松散不黏手且呈淡黃色。同時，粗蛋白質和干物質含量均有所提高，pH、中性洗滌纖維與酸性洗滌纖維含量降低。Song等通過纖維素酶－木聚糖酶共同處理使玉米秸稈轉化率達到48.5%，并且證實了纖維素酶－木聚糖酶的協(xié)同作用高于單一酶處理。毛建紅通過添加纖維素酶、果膠酶、布氏乳酸桿菌發(fā)酵玉米秸稈后，中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、纖維素、半纖維素含量顯著降低，改善了秸稈營養(yǎng)品質。張仲卿等用擬康寧木霉和黃孢原毛平革菌混合發(fā)酵玉米秸稈，試驗表明混合發(fā)酵均高于單一菌株發(fā)酵，其纖維素和木質素降解率分別達到36.80%和28.87%。本試驗結果與上述相關研究結果一致。具有不同降解功能的微生物之間存在互生和共生的關系，將其進行適當比例的組合可能會取得更好的應用效果。一般認為，pH在4.0以下為優(yōu)質發(fā)酵飼料。薛艷林等在秸稈發(fā)酵中添加生物制劑可有效提高發(fā)酵飼料品質，迅速降低pH，抑制有害微生物的增殖，減少飼料營養(yǎng)物質的損失，使發(fā)酵飼料留存更多的營養(yǎng)物質。郭萌萌通過添加乳酸菌、酵母菌、芽孢桿菌等復合菌發(fā)酵玉米秸稈，將發(fā)酵環(huán)境中pH降低至適宜的pH，從而控制有害菌的增長。在本研究中，添加黃孢原毛平革菌和纖維素酶后，pH迅速降低，且未出現增高現象，使得發(fā)酵品質得到明顯改善。

本試驗中，發(fā)酵秸稈乳酸含量顯著高于未發(fā)酵秸稈，乳酸的產量與發(fā)酵飼料的品質有直接影響，乳酸的產生可有效抑制其他腐敗菌的生長。菌酶復合制劑發(fā)酵秸稈較高的乳酸含量可能由于纖維素酶和黃孢原毛平革菌共同分解植物細胞壁，從而增加降解菌可利用的發(fā)酵底物，將碳水化合物進行生物降解，轉化為有機酸。與未發(fā)酵秸稈相比，在整個發(fā)酵過程中菌酶復合制劑發(fā)酵秸稈的pH較低，這可能導致發(fā)酵秸稈氨態(tài)氮含量降低。本試驗結果與在玉米秸稈青貯中添加乳酸菌及纖維素酶混合發(fā)酵改善青貯發(fā)酵品質的結果一致。

楊世帆等研究表明，乙酸含量產生與青貯品質呈負相關，對黃貯也是如此，乙酸會使發(fā)酵飼料產生酸味，降低適口性，并產生刺鼻的氣味。丁酸是發(fā)酵中應盡量避免出現的有機酸，丁酸是源自含氮化合物的分解，使蛋白質分解，并降低其營養(yǎng)價值。本試驗中，丙酸和乙酸含量與未發(fā)酵秸稈相比均無顯著差異，發(fā)酵前后均未檢測出丁酸，說明添加黃孢原毛平革菌和纖維素酶可提高玉米秸稈的發(fā)酵效果，且無有害酸產生。賈晶霞等在研究玉米秸稈發(fā)酵過程中粗蛋白質含量呈上升趨勢，這是因為微生物大量利用原料中的可溶性糖，而利用其蛋白質較少，從而使粗蛋白質相對含量升高。李川東等認為，在發(fā)酵過程中微生物的相互競爭死亡所產生出的菌體蛋白，增加了蛋白質含量。岳麗等通過添加黑曲霉和產朊假絲酵母發(fā)酵甜高粱秸稈，將粗蛋白質含量提高至18.79%。混合發(fā)酵可產生酶系互補的作用，且對合成一系列酶過程具有一定的反饋調節(jié)作用，從而增加蛋白酶和纖維素酶的活性。本試驗中，發(fā)酵秸稈的粗蛋白質含量顯著高于對照組，可能是黃孢原毛平革菌通過對木質素結構的破壞釋放出來的纖維素和半纖維被纖維素酶分解為單糖，促進菌絲的生長，增加菌體蛋白，從而提高了發(fā)酵秸稈中粗蛋白質的含量。玉米秸稈具有一定的營養(yǎng)價值，但木質素、纖維素含量過高，嚴重影響其利用價值。本研究中，發(fā)酵秸稈的酸性洗滌木質素、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維含量顯著低于未發(fā)酵秸稈，提高了秸稈的利用價值。在色澤、氣味、質地感官評價方面，發(fā)酵秸稈品質明顯優(yōu)于未發(fā)酵秸稈，接近優(yōu)質發(fā)酵。

4結論

通過均勻設計篩選出最佳發(fā)酵條件為:纖維素酶添加量0.2g/kg、木聚糖酶添加量0.1g/kg、黃孢原毛平革菌接種量20%、發(fā)酵天數19d，此條件下中性洗滌纖維降解率為23.47%，酸性洗滌纖維降解率為20.13%。在最佳發(fā)酵條件下，該菌酶復合制劑發(fā)酵玉米秸稈可顯著提高秸稈的發(fā)酵品質和營養(yǎng)價值。

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