纖維素分解菌與乳酸菌復(fù)合發(fā)酵條件的響應(yīng)曲面優(yōu)化分析
響應(yīng)曲面優(yōu)化法(response surface methodology,RSM)是一種實驗條件優(yōu)化的方法,適宜解決各類非線性數(shù)據(jù)處理的相關(guān)問題。其主要優(yōu)勢在于可對實驗水平進行連續(xù)的分析,而不是僅對孤立的實驗點進行,所以具有普通正交實驗方法無法比擬的優(yōu)越性。且此方法因研究的關(guān)系簡單(各因子間、因子與響應(yīng)值間)、省時準(zhǔn)確等,所以常被認為是降低開發(fā)成本、優(yōu)化加工條件、解決生產(chǎn)過程中實際問題的一種最為有效的方法,已被廣泛地應(yīng)用于各個領(lǐng)域。當(dāng)前,采用響應(yīng)曲面分析法主要是對發(fā)酵工藝參數(shù)和條件等進行優(yōu)化,而少見利用此方法優(yōu)化青貯玉米外源添加菌種量和比例的相關(guān)研究。
青貯玉米原料附著多種微生物,其中有益微生物主要為同型或異性發(fā)酵乳酸菌,有害微生物多以真菌為主。也有研究表明,某些真菌作為青貯添加劑添加,其不僅不會破壞原有的發(fā)酵過程,且可有效降低發(fā)酵底物的纖維素含量。其中黑曲霉(Aspergillus niger)作為我國農(nóng)業(yè)部和美國FDA 認證的安全菌種,可產(chǎn)生活性較高的多種胞外酶,適合飼用復(fù)合酶的固體發(fā)酵。綠色木霉(Trichoderma viride)作為自然界中普遍存在的真菌,其不但可以產(chǎn)生多種具有生物活性的酶系,且對植物病理生物防治具有重要的作用。此外,某些細菌如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生產(chǎn)菌,具有抑制大腸桿菌、沙門氏菌生長,以及對植物病原真菌的溶菌等作用。此外,上述菌種產(chǎn)生的酶系(糖化酶、纖維素酶、木聚糖酶等多種胞外酶)可將發(fā)酵底物中的多糖降解為寡糖和單糖,一方面可為菌體生長提供豐富的營養(yǎng)底物,另一方面對于青貯原料,可顯著降低發(fā)酵體系內(nèi)銨態(tài)氮和總氮的比值、中/酸性洗滌纖維含量、丁酸與總酸的比值,并大幅抑制了青貯有害微生物的生長。以往諸多研究均表明,酶系是否在青貯中發(fā)揮作用既要控制青貯發(fā)酵的環(huán)境,也要充分考慮發(fā)酵菌種間的協(xié)同性。因此控制這些微生物的合理繁殖是調(diào)制優(yōu)質(zhì)青貯的重要前提之一。鑒于此,本研究擬采用響應(yīng)曲面法,探究外源添加劑同、異型發(fā)酵乳酸菌和纖維素分解菌菌群(黑曲霉、綠色木霉、枯草芽孢桿菌)復(fù)合發(fā)酵的理論最佳發(fā)酵比例和劑量,為青貯玉米發(fā)酵提質(zhì)降耗的理論研究提供基礎(chǔ),并為我國新型青貯添加劑的開發(fā)提供依據(jù)。
1.1 主要材料 本研究主要菌種為購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(agricultural culture collection of china,ACCC)的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum,ACCC 11016)、戊糖片球菌(Pediococcus acidilactici,ACCC 05481)、枯草芽孢桿菌(bacillus subtilis,ACCC 19374)、黑曲霉(aspergillus niger,ACCC 30134)和綠色木霉(trichoderma viride,ACCC 30595)。購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection,CICC)的布氏乳桿菌(Lactobacillus buchneri,CICC 20293)。 1.2 試驗設(shè)計 通過查閱關(guān)于添加同、異型發(fā)酵乳酸菌(LAB)發(fā)酵青貯玉米的相關(guān)文獻,初步確定兩類LAB 的添加量為1×105、3×105 和5×105 cfu·g-1 (即5、5.48、5.70 lg cfu·g-1),其中同型發(fā)酵乳酸菌為植物乳桿菌和戊糖片球菌等比例混合(菌種數(shù)量比為1∶1)的復(fù)合菌,異型發(fā)酵LAB為布氏乳桿菌。纖維素分解菌菌群的添加比例為,黑曲霉∶綠色木霉∶枯草芽孢桿菌分別為1∶1∶2、1∶2∶1和2∶1∶1,添加量分別為0.1、0.2和0.3％。然后進行響應(yīng)曲面分析,優(yōu)化各菌種比例和添加量。 1.3 指標(biāo)測定及方法 將各個菌種復(fù)壯后,接種至選擇性培養(yǎng)基中擴繁,其中LAB采用MRS液體培養(yǎng)基[配方:酪蛋白胨10.0g,牛肉粉8.0g,酵母粉4.0g,葡萄糖20.0g,硫酸鎂0.2g,乙酸鈉5.0g,檸檬酸二銨2.0g,磷酸氫二鉀2.0g,硫酸錳0.05g,吐溫801.0g,蒸餾水1L,pH (6.2±0.2)],真菌Aspergillus niger、Trichoderma viride采用PDA 液體培養(yǎng)基(配方:馬鈴薯提取液1L,葡萄糖20.0g,自然pH),bacillus subtilis采用LB培養(yǎng)基(配方:酵母提取物5.0g,蛋白胨10.0g,氯化鈉10.0g,蒸餾水1L,pH7.0±0.2)。然后進行響應(yīng)曲面優(yōu)化,設(shè)計方法為BBD(Box-Behnken Design),本研究中響應(yīng)值為LAB和真菌的數(shù)量,自變量分別為同型發(fā)酵LAB添加量、異型發(fā)酵LAB添加量、纖維素分解菌菌群比例和劑量,分別以A、B、C和D代表,每個自變量的3個試驗水平(低、中、高)編碼分別為-1、0、1(表1)。1試驗材料與方法
然后將各個擴繁后的菌液按照BBD 設(shè)計的添加比例和量進行混合,厭氧培養(yǎng)3d后(35℃,pH4.5)測定液體培養(yǎng)基中LAB和真菌的數(shù)量,具體采用傳統(tǒng)菌種計數(shù)法計數(shù)，每個梯度做3個重復(fù)。取菌落數(shù)在30~300的平板作為有效計數(shù)板,菌落以肉眼可見為準(zhǔn),每克鮮樣(FM)中微生物的數(shù)量,即菌落形成單位(cfu),計算方法為:
微生物數(shù)量＝菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×1000/涂布吸樣量。
1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
數(shù)據(jù)的初步整理和統(tǒng)計采用Microsoft Excel 2011軟件。采用DesignExpert軟件進行響應(yīng)曲面優(yōu)化,設(shè)通過最小二乘法擬合的二次多項式模型為:
式中:Y 為預(yù)測響應(yīng)值,即LAB或真菌數(shù)量的預(yù)測值;xi 和xj 為自變量的編碼值,c0 為常數(shù)項,ai 為線性系數(shù),bij 為二次項系數(shù),n 為因子數(shù)(n ＝4)。按照BBD試驗設(shè)計的統(tǒng)計學(xué)要求對二次多項式中各試驗進行回歸擬合,擬合后獲得回歸方程,運用軟件中自帶功能,選取兩個預(yù)測值均為最大(Y1 為LAB,Y2 為真菌數(shù)量),以此得到最佳的各水平編碼值,最終計算求得各個變量的最佳組合。
2.1 模型建立與顯著性檢驗分析 采用BBD設(shè)計得到變量代碼,按照變量代碼進行試驗,結(jié)果測得LAB最大值為9.96 lg cfu·g-1,其代碼為1(A)、1(B)、0(C)、0(D);最小值為7.93 lg cfu·g-1,其代碼為-1(A)、0(B)、-1(C)、0(D),總體平均值為8.63 lg cfu·g-1,總體標(biāo)準(zhǔn)差(SD)為0.16,變異系數(shù)(CV)為1.89％.真菌測得最大值為5.23lgcfu·g-1,其代碼為0(A)、1(B)、0(C)、1(D);最小值為3.92lgcfu·g-1,其代碼為1(A)、1(B)、0(C)、0(D),總體平均值為4.49lgcfu·g-1,總體SD為0.27,CV 為6.05％(表2)。2結(jié)果與分析
利用DesignExpert軟件,將表2的Y1 和Y2 數(shù)據(jù)按二次多項式模型進行多元回歸擬合,獲得Y1 和Y2 對編碼自變量A、B、C和D的二次多項回歸方程(表3):
Y1 ＝8.56＋0.50A ＋0.50B ＋0.07C ＋0.04D ＋0.09A2＋0.11B2-0.01C2－2.58×10－3D2＋0.21AB ＋0.06AC-0.04AD-0.04BC-0.06BD＋0.08CD;
Y2＝4.38-0.02A -0.05B－8.33×10－3C＋0.32D－3.58×10－3A2 -0.04B2 -0.03C2＋0.35D2 -0.17AB＋0.30AC-0.01AD-0.18BC＋0.18BD-0.04CD。
通過對Y1、Y2 兩個模型的方差分析可知(表3),本研究所選用的二次多項式模型顯著性為:Y1,F＝17.23,P＜0.01;Y2,F＝2.83,P＝0.03.失擬項均不顯著(Y1:P＝0.50,Y2:P＝0.68).決定系數(shù)R2 分別為Y1＝0.95,Y2 ＝0.74.矯正決定系數(shù)R2adj 分別為Y1＝0.89,Y2＝0.48.顯著性檢驗結(jié)果表明(表3),Y1模型中試驗因素A 和B對LAB數(shù)量的曲面效應(yīng)影響均極顯著(P＜0.01),因素A 和B的交互作用影響顯著(P＝0.02),其余因素及各因素間的交互作用影響均不顯著(P＞0.05).Y2 模型中僅試驗因素D、因素A 和B的交互作用對真菌數(shù)量的曲面效應(yīng)影響顯著(P＜0.05),其余各因素及因素間的交互作用影響均不顯著(P＞0.05)。
2.2 復(fù)合發(fā)酵真菌和乳酸菌數(shù)量的響應(yīng)
曲面分析通過對Y1 所繪制的響應(yīng)曲面圖及等高線圖可知(圖1),A 和B兩個因素的交互對Y1 影響最大,當(dāng)A和B的代碼越接近于1,Y1 的值越趨于最大值(9.96 lg cfu·g-1)。A 和C、D 因素的交互作用中,起主要作用的均為因素A.B和C、D因素的交互作用中,起主要作用的均為因素B.C和D兩個因素的交互對Y1 的值基本無影響(P ＝0.36)。總體來看,僅A 和B因素的交互作用影響顯著(P ＝0.02),其余兩因素的交互作用對Y1 的值影響均不大(P＞0.05)(表3)。通過對Y2 所繪制的響應(yīng)曲面圖及等高線圖可知(圖2),對Y2 的值起主要作用的為因素D,且因素D 和其他因素的交互作用中因素D也也起到主要作用,但總體來看,除A、B因素交互作用外,其余各因素之間的交互作用對Y2 的值影響均不大(P ＞0.05)(表3)。最終利用軟件求出Y1 和Y2 均為最大值的代碼解(最優(yōu)解)為A＝1.000,B＝0.853,C＝1.000,D＝0.996,將代碼解換算成實際自變量可得,同型發(fā)酵LAB添加量為5×105 cfu·g-1(5.70 lg cfu·g-1),異型發(fā)酵LAB 添加量為4.7×105 cfu·g-1 (5.67 lg cfu·g-1),纖維素分解菌比例為2∶1∶1,添加量為0.3％。
討 論
以往研究很少對多種類菌種的復(fù)合發(fā)酵進行研究,類似研究多在發(fā)酵堆肥中使用。本研究對LAB和纖維素分解菌復(fù)合發(fā)酵的發(fā)酵比例劑量進行了優(yōu)化,而在實際發(fā)酵過程中,由于真菌和細菌的生長環(huán)境不同(好氧/厭氧)而在復(fù)合培養(yǎng)情況下僅能確定一種生長環(huán)境,因此本研究模擬青貯發(fā)酵初期的好養(yǎng)環(huán)境對復(fù)合菌種進行了優(yōu)化,得到的結(jié)果能很好地為今后青貯復(fù)合發(fā)酵添加劑的開發(fā)提供理論方法。此外,由于多種菌劑的復(fù)合發(fā)酵體系比較復(fù)雜,本研究僅對其進行了初步的探索,因此還需要繼續(xù)開展實踐研究。 本研究對復(fù)合菌種發(fā)酵體系內(nèi)的LAB數(shù)量進行優(yōu)化,而未對傳統(tǒng)概念上認識的pH、乳酸或乙酸含量等發(fā)酵產(chǎn)物進行優(yōu)化。其一方面原因為,LAB的代謝產(chǎn)物較多,產(chǎn)生情況較為復(fù)雜,且受發(fā)酵環(huán)境和底物的影響極大,而無論其代謝產(chǎn)物種類如何,其必然受自身數(shù)量的影響。另一方面,由于本研究中探究復(fù)合發(fā)酵體系,單純以某種LAB的代謝產(chǎn)物進行優(yōu)化,并和真菌數(shù)量進行響應(yīng)面分析,不能反映整體情況,且指標(biāo)上不具有統(tǒng)一性。另外,選取多個LAB的多種代謝產(chǎn)物進行優(yōu)化,其操作性較差,不易進行響應(yīng)曲面優(yōu)化。復(fù)合體系中將真菌數(shù)量作為另一個優(yōu)化指標(biāo),其主要原因為本研究選取的能產(chǎn)生胞外酶的微生物,其產(chǎn)酶含量與數(shù)量呈顯著正相關(guān)關(guān)系,以數(shù)量為響應(yīng)值即能很好的反映產(chǎn)酶的含量。 眾所周知,LAB有抑制真菌生長的特性,而本研究需要真菌在青貯玉米發(fā)酵初期發(fā)揮其產(chǎn)胞外酶的特性,因此對好氧情況下真菌和LAB均達到最大值的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。研究發(fā)現(xiàn),在確定的4個發(fā)酵條件中,同、異型發(fā)酵LAB的數(shù)量以及其交互作用對總體LAB數(shù)量影響最大(表3),且當(dāng)兩類LAB數(shù)量最多時,總體LAB數(shù)量也最多,這與LAB生物學(xué)基礎(chǔ)理論相同。在發(fā)酵體系內(nèi)加入的纖維素分解菌菌群的比例和劑量兩個因素對LAB數(shù)量無顯著影響(P ＞0.05),也進而證明了LAB數(shù)量并未受纖維素分解菌的抑制,這與諸多的研究結(jié)果相似,他們也都認為在厭氧條件下真菌不會抑制LAB 的生長。另外,本研究為多種類菌種的復(fù)合發(fā)酵,因此選用的培養(yǎng)條件不可能達到所有菌種最適的生長環(huán)境,且實際生產(chǎn)中青貯玉米的發(fā)酵環(huán)境也難于控制,所以本研究僅模擬了青貯發(fā)酵初期(3d內(nèi))的環(huán)境進行研究，這可能也是導(dǎo)致LAB生長不受真菌抑制的主要原因。本研究還發(fā)現(xiàn),在確定的4個發(fā)酵條件中,影響真菌數(shù)量的主要因素為纖維素分解菌的添加劑量,且同、異型發(fā)酵LAB添加量的交互作用對真菌也有顯著影響(P＜0.05),而纖維素分解菌的添加比例對其無顯著影響(表3)(P＞0.05),由此也進一步證實了LAB對真菌的抑制作用。另外,纖維素分解菌的比例和添加量的交互作用中以添加量為主導(dǎo),其添加量越高,真菌數(shù)量越高(圖2。這也說明了真菌添加劑量對其數(shù)量起到了決定性作用。值得注意的是,當(dāng)纖維素分解菌的添加比例分別與同/異型發(fā)酵LAB添加量交互時,其產(chǎn)生了較大變異(圖2),這可能是不同種LAB抑制真菌的種類不同所致，其具體原因還有待進一步分析研究。除此之外,當(dāng)纖維素分解菌的添加劑量分別與同/異質(zhì)型LAB 添加量交互時,抑制真菌的效果異性發(fā)酵優(yōu)于同型發(fā)酵(圖２),這表明異型發(fā)酵LAB產(chǎn)抑制真菌生長的乙酸含量高于同型發(fā)酵LAB。
結(jié) 論
1)LAB數(shù)量(Y1)和真菌數(shù)量(Y2)對編碼自變量A(同型發(fā)酵LAB 添加量)、B (異型發(fā)酵LAB 添加量)、C(纖維素分解菌比例)和D (纖維素分解菌添加劑量％)的二次多項回歸方程為: Y1＝8.56＋0.50A ＋0.50B ＋0.07C ＋0.04D ＋0.09A2＋0.11B2 －0.01C2 －2.58×10-3 D2 ＋0.21AB＋0.06AC －0.04AD －0.04BC －0.06BD ＋0.08CD ; Y2＝4.38－0.02A －0.05B －8.33×10-3C ＋0.32D－3.58×10-3A2 －0.04B2 －0.03C2 ＋0.35D2 －0.17AB＋0.30AC－0.01AD －0.18BC ＋0.18BD －0.04CD。 2)響應(yīng)曲面分析法優(yōu)化試驗條件結(jié)果為,同型發(fā)酵LAB添加量為5×105 cfu·g-1,異型發(fā)酵LAB添加量為4.7×105 cfu·g-1,纖維素分解菌比例黑曲霉∶綠色木霉菌∶枯草芽孢菌為2∶1∶1,添加量為0.3％。
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