近年來，隨著飼用抗生素使用的逐步受限，如何保障畜禽健康成為我國畜牧業(yè)的一大挑戰(zhàn)。玉米和豆粕是目前仔豬生產(chǎn)上主要的飼料原料，而豆粕中的抗原蛋白、胰蛋白酶抑制劑及植酸等抗營養(yǎng)因子會阻礙消化道吸收利用營養(yǎng)物質(zhì)，不利于動物生長和健康。研究表明，生物發(fā)酵能有效降解飼料中的抗營養(yǎng)因子，促進養(yǎng)分的消化吸收，改善動物健康，減少飼用抗生素(促生長)的使用。選取合適的微生物進行飼料的發(fā)酵能有效降解飼料中的抗營養(yǎng)因子，促進養(yǎng)分的消化吸收，分泌的代謝產(chǎn)物如小肽，有機酸等利于改善動物健康。

目前乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌被廣泛引用于飼料發(fā)酵。其中，乳酸菌產(chǎn)生的有機酸、細菌素等代謝產(chǎn)物有利于改善飼料的營養(yǎng)品質(zhì)，酵母菌能降解豆粕中的水蘇糖、棉子糖，而枯草芽孢桿菌對豆粕中抗原蛋白具有較強的降解效果。多菌株混合發(fā)酵理論上可以發(fā)揮不同菌株的發(fā)酵特性，但是不同菌株間存在可能存在拮抗作用，比如，當米曲霉和干酪乳桿菌直接混合發(fā)酵豆粕，會降低米曲霉對豆粕中抗原蛋白的降解效果。而采用菌酶協(xié)同發(fā)酵，可以提高發(fā)酵過程中微生物對飼料中大分子物質(zhì)利用效率，如纖維素酶水解秸桿生成的單糖能為酵母菌合成菌體蛋白提供能量，進而提高飼料品質(zhì)。

本研究以玉米、豆粕作為主要的發(fā)酵原料，通過單菌固態(tài)發(fā)酵比較不同菌株對飼料成分及營養(yǎng)價值的影響。進一步采用混菌發(fā)酵和菌酶協(xié)同的方式優(yōu)化飼料的發(fā)酵工藝，制備抗營養(yǎng)因子含量低同時乳酸含量高的生物發(fā)酵飼料。隨后通過仔豬飼喂實驗對比生物發(fā)酵復合飼料與并將發(fā)酵飼料飼喂仔豬，檢驗飼料對于仔豬生長性能的影響，為實際生產(chǎn)中的應用提供參考。

實驗菌株：枯草芽孢桿菌BS12為本研究室自行分離的菌株，枯草芽孢桿菌CICC20076和枯草芽孢桿菌CICC20070：中國工業(yè)微生物菌株保藏管理中心(CICC)；糞腸球菌EF(原始編號NCIMB10415)：山東寶來利來公司；干酪乳桿菌LC和植物乳桿菌LP為本實驗室自行分離的菌株；釀酒酵母:中國工業(yè)微生物菌株保藏管理中心(CICC)；

豆粕：浙江某生物發(fā)酵公司。復合酶制劑：廣東某酶制劑公司。

主要儀器：Kjeltec8400

全自動凱氏定氮儀：德國FOSS公司；L-8900

全自動氨基酸分析儀：日本Hitachi公司；

SpectraMaxM5酶標儀：美國Molecular Devices公司等。

取9g豆粕、9g玉米粉、2g麩皮于100mL三角瓶中攪拌均勻后配成復合飼料，于105℃滅菌15min，按接種量5%分別加入枯草芽孢桿菌CICC20076、枯草芽孢桿菌CICC21076、枯草芽孢桿菌BS12、釀酒酵母CICC1520、糞腸球菌EF、干酪乳酸菌LC和植物乳桿菌LP的種子液，同時加入滅菌水至飼料總含水量為45%，發(fā)酵體系內(nèi)菌濃度達到1.0×10⁷CFU/g，攪拌均勻后于37℃恒溫培養(yǎng)，進行固態(tài)發(fā)酵。實驗根據(jù)菌的種類不同共設7個組，每組3個重復，其中枯草芽孢桿菌CICC20076組、枯草芽孢桿菌CICC21076組和枯草芽孢桿菌BS12組發(fā)酵24h，釀酒酵母CICC1520組發(fā)酵48h，糞腸球菌EF組、干酪乳酸菌LC組和植物乳桿菌LP組發(fā)酵48h。發(fā)酵結束后，將發(fā)酵飼料于60℃烘干，粉碎過60目篩后，測定發(fā)酵飼料中粗蛋白、豆粕抗原蛋白、中性洗滌纖維、酸溶蛋白以及乳酸含量。

將篩選出了芽孢桿菌BS12與糞腸球菌EF以不同比例添加入復合飼料，添加比如表1所示，按2.1方法先進行24h好氧發(fā)酵，再進行48h厭氧發(fā)酵，選取最優(yōu)的發(fā)酵比例。

為彌補細菌對纖維降解的不足。本研究中采用復合酶(主成分為：纖維素酶、甘露糖酶、果膠酶)強化飼料纖維的降解。分別以質(zhì)量比0.3%、0.5%、0.7%和1.0%加入復合飼料中，隨后經(jīng)過枯草芽孢桿菌BS12和糞腸球菌EF分步發(fā)酵后，測定發(fā)酵飼料中中性洗滌纖維含量。

兩步酶法測定發(fā)酵復合飼料的體外消化率參考Sakamoto等的方法進行。分別取3g發(fā)酵復合飼料和未發(fā)酵復合飼料，裝入150mL三角瓶中。加入30mL 10000U/mL的胃蛋白酶溶液(3000U/mg，Sigma)，用0.05mol/L KCl-HCl緩沖液調(diào)整至pH為2.0，隨后在39℃，150r/min條件下振蕩消化4h。隨后用1mol/L NaOH調(diào)整溶液pH為7.0，加入150mg胰蛋白酶(250U/mg，Sigma)于39℃，150r/min繼續(xù)消化4h。最后加入5mL 20%的磺基水楊酸溶液終止反應，沉淀30min。消化后的溶液在3000r/min條件下離心15min，棄上清。剩余的殘渣在105℃條件下烘干處理4h，獲得殘渣樣本。參照國標《GB/T6432—1994》檢測發(fā)酵前后飼料中的粗蛋白含量，參照國標《GB/T18246—2000》檢測殘渣中粗蛋白和氨基酸的含量。

體外消化率按照如下的公式計算：

玉米、豆粕和麩皮按45%、45%和10%的比例混合均勻，取200kg的玉米豆粕復合飼料，按5%比例分別接種芽孢桿菌BS12、糞腸球菌EF和5%的復合酶制劑，初始濕度控制在40%左右，室溫條件下(30℃)好氧發(fā)酵24h后；隨后裝入?yún)捬醢l(fā)酵袋，室溫條件下厭氧發(fā)酵48h后烘干粉碎待用。

選取192頭體重在(9.35±0.65)kg的49日齡健康仔豬(Duroc×Large white×Yorkshire)，隨機分配至兩個處理組，每個處理6個重復，每個重復16頭。處理組1飼喂玉米豆粕基礎日糧(對照組)，日糧中添加100mg/kg喹乙醇和50mg/kg吉他霉素；處理組2以10%發(fā)酵飼料替代基礎日糧中的玉米和豆粕(發(fā)酵飼料組)，且日糧中不添加抗生素，實驗期為24d。于實驗期1d及24d稱取仔豬初始體重及末重，每日記錄采食量、計算平均日增重。實驗日糧組成及營養(yǎng)水平見表2。

飼料中抗原蛋白含量的測定采用龍科方舟試劑盒根據(jù)酶聯(lián)免疫(ELISA)法進行測定；粗蛋白的測定參照《GB/T 6432—1994》；粗脂肪的測定參照《GB/T 6433—1994》；中性洗滌纖維的測定參照《GB/T 20806—2006》；飼料中鈣的測定參照《GB/T 6436—2002》；總磷的測定參照《GB/T 6437—2002》；酸溶蛋白的測定參照Mahmoudreza等的研究；飼料中乳酸采用羥基聯(lián)苯比色法測定；飼料pH采用pH計直接測定。

采用SPSS19.0對實驗結果進行分析處理，采用ANOVA進行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，所有結果均以平均數(shù)±標準差表示。

如表4所示，枯草芽孢桿菌BS12的比例提高有利于提高飼料中抗原蛋白的降解率和酸溶蛋白的含量。盡管糞腸球菌EF的含量減小，飼料中乳酸含量差異并不顯著。采用當飼料中總菌量達到1.0×10⁷CFU/g，芽孢桿菌BS12和糞腸球菌比例8:1時，進行先好氧發(fā)酵24h，再厭氧發(fā)酵48h，飼料中大豆球蛋白含量減少至8.31mg/g，β-伴球蛋白含量降低至6.44mg/g，酸溶蛋白相較發(fā)酵前提高6.16倍，乳酸含量達到116.57mg/g。

由表5可知，添加纖維素酶、甘露糖酶及果膠酶制備的后，發(fā)酵飼料中性洗滌纖維降解程度提高。添加量為0.30%、0.50%、0.70%和1.00%時，相較于未發(fā)酵飼料，中性洗滌纖維降解率分別為35.41%、39.36%、40.32%和40.61%。但是抗原蛋白降解程度及乳酸含量變化并不顯著。

由圖1可見，經(jīng)過發(fā)酵后，飼料中粗蛋白消化率也得到提高，6種必需氨基酸和5種非必須氨基酸體外消化率得到顯著提高。其中，蛋氨酸、苯丙氨酸分別提高15.15%和17.60%，丙氨酸，半胱氨酸，色氨酸分別提高了10.11%、10.05%和9.89%，粗蛋白消化率整體提高6.94%。

通過生物發(fā)酵降低飼料中抗營養(yǎng)因子的含量，從而提高動物對飼料養(yǎng)分的消化利用率，已成為飼料工業(yè)發(fā)展的重要方向。目前研究多為發(fā)酵單一原料，如發(fā)酵豆粕、發(fā)酵菜粕和發(fā)酵DDGS。但是對于混合原料發(fā)酵的研究并不充分。本研究以玉米、豆粕和麩皮配制成混合原料，采用枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、糞腸球菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌進行發(fā)酵實驗，通過比較不同菌株對飼料中抗原蛋白降解程度、纖維降解程度及發(fā)酵后飼料中乳酸含量的影響，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌對飼料原料中蛋白和纖維的降解程度更高，乳酸菌產(chǎn)乳酸能力更強。Chi等也發(fā)現(xiàn)相較于酵母菌和乳酸菌，解淀粉芽孢桿菌對豆粕蛋白的降解程度更高。這可能是由于芽孢桿菌能分泌大量蛋白酶和纖維素酶，對大分子蛋白和纖維降解能力較強。乳酸菌雖然可以發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，但是在固態(tài)發(fā)酵中對飼料中抗原蛋白的降解能力不強。

為綜合芽孢桿菌對豆粕抗原蛋白的降解特性與乳酸菌的產(chǎn)乳酸特性，本研究選取了枯草芽孢桿菌中對蛋白和纖維降解性較能強的BS12和乳酸菌中產(chǎn)酸能力較強的糞腸球菌EF進行混菌發(fā)酵實驗。但是，枯草芽孢桿菌為好氧細菌，而糞腸球菌為兼性厭氧細菌，完全進行好氧發(fā)酵或厭氧發(fā)酵會抑制其中一種菌的生長。Chen等采用分步發(fā)酵的方法用米曲霉先降低豆粕中的抗原蛋白，再用干酪乳桿菌發(fā)酵提高乳酸含量，降低豆粕pH。曲露等采用先好氧再厭氧的分步發(fā)酵方式，先降低菜籽粕中的硫甙和植酸，并提高粗蛋白及小肽含量，再通過厭氧發(fā)酵增加有機酸提高風味。本研究采用同步加菌，先好氧發(fā)酵24h，再厭氧發(fā)酵48h的工藝。分步發(fā)酵降低了飼料中的抗原蛋白，且抗原蛋白降解程度和BS12單菌發(fā)酵相似，而乳酸含量也與EF單菌發(fā)酵結果相當。這說明，分步發(fā)酵工藝同樣適用于玉米－豆粕型復合飼料的發(fā)酵。

飼料原料中含有大量的植物纖維。其中中性洗滌纖維過高會增加食糜黏度，阻礙其在仔豬腸道內(nèi)的正常推進，增強飽腹感，降低采食量。非淀粉多糖酶有助于分解細胞壁，釋放營養(yǎng)成分，提高干物質(zhì)、有機物及粗蛋白的消化利用率。本研究采用通過添加復合酶對發(fā)酵飼料進一步優(yōu)化。結果顯示，發(fā)酵過程添加非淀粉多糖復合酶(纖維素酶、甘露糖酶和果膠酶)，進一步降低了飼料中的中性洗滌纖維含量。發(fā)酵后，粗蛋白、蛋氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸，半胱氨酸和色氨酸的體外消化率提高明顯。其中，蛋氨酸、丙苯氨酸和色氨酸是豬日糧中的必需氨基酸，而半胱氨酸是半必需氨基酸。倪良振等研究發(fā)現(xiàn)，在含5.8%酸性洗滌纖維的日糧中添加纖維素酶極顯著提高煙臺黑豬對蛋氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸的回腸表觀消化率。因此，采用非淀粉多糖酶和枯草芽孢桿菌、糞腸球菌協(xié)同發(fā)酵降解飼料中的大分子蛋白和纖維，產(chǎn)生小分子肽和游離氨基酸，更有利于仔豬對氨基酸的消化利用。

仔豬飼喂實驗進一步證明，相較于添加了抗生素的對照組，采用10%的菌酶協(xié)同發(fā)酵復合飼料有利于提高仔豬生長性能，且料肉比和腹瀉率并未發(fā)生顯著變化。

本研究通過發(fā)酵實驗篩選了1株高效降解豆粕抗原蛋白的枯草芽孢桿菌BS12和1株產(chǎn)乳酸能力較強的糞腸球菌EF，用于玉米豆粕型復合飼料的發(fā)酵。結果顯示，將BS12與EF按總菌量1.0×10⁷CFU/g，菌量比8:1接種于復合飼料，同時接入0.5%的復合酶，發(fā)酵72h，可降解飼料中80%的大豆抗原蛋白，且乳酸含量達到122.18mmol/kg。所得發(fā)酵復合飼料提高了仔豬采食量和日增重，有利于提高仔豬生長性能，減少飼用抗生素使用。