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導(dǎo)讀

乳酸菌是發(fā)酵糖類且主要產(chǎn)物為乳酸的一類無芽孢和革蘭染色陽性細(xì)菌的總稱，乳酸菌廣泛存在于自然界和人和動物的消化系統(tǒng)中，幾乎所有菌型都對人和動物無毒無害，可維護(hù)人和動物的身體健康。乳酸菌具備多種有益功能，其在醫(yī)藥、生物技術(shù)、食品和飼料等領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用。截至2010年，我國乳酸菌產(chǎn)業(yè)規(guī)模已經(jīng)超過200億元，產(chǎn)量突破160萬t。在養(yǎng)殖業(yè)中，抗生素的使用日漸威脅人類健康和環(huán)境安全，世界各國已普遍禁用或限用飼用抗生素;此外，微生物飼料添加劑已經(jīng)在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中得到廣泛地認(rèn)可和使用，其中最受推崇的微生物飼料添加劑之一就是乳酸菌。乳酸菌在動物體內(nèi)能發(fā)揮許多生理功能，有促進(jìn)動物生長，調(diào)節(jié)胃腸道正常菌群，維持微生態(tài)平衡及改善胃腸道的功能，可提高食物消化率和生物效價，降低血清膽固醇及控制內(nèi)毒素，抑制腸道內(nèi)腐敗菌生長，提高機(jī)體免疫力及防治多種腸道疾病。2008年12月中華人民共和國農(nóng)業(yè)部1126號公告《飼料添加劑品種目錄(2008)》中規(guī)定可直接飼喂動物的飼料級微生物添加劑菌種:地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、兩歧雙歧桿菌、糞腸球菌、屎腸球菌、乳酸腸球菌、嗜酸性乳桿菌、干酪乳桿菌、乳酸乳桿菌、植物乳桿菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、產(chǎn)朊假絲酵母、釀酒酵母、沼澤紅假單胞菌和保加利亞乳桿菌，共16種，其中11種為乳酸菌。

盡管乳酸菌在養(yǎng)殖業(yè)中意義重大，但其作為生物飼料添加劑的規(guī)模還比較小，目前市場份額約為10億元，其主要原因在于目前乳酸菌的研究和應(yīng)用更多地集中在發(fā)酵乳制品(益生菌酸奶、益生菌發(fā)酵乳飲料和益生菌奶酪)、發(fā)酵豆乳制品、功能性食品配料、食品添加劑(在嬰兒配方乳粉、中老年乳粉和果汁等中的添加等)和膳食補(bǔ)充劑(片劑和膠囊等)等方面上，研究方向更多地集中在發(fā)酵菌劑的研制和使用等。規(guī)模的局限也造成乳酸菌飼料添加劑研發(fā)滯后。要為消費(fèi)者提供更多健康的肉類食品，就必須加快乳酸菌工業(yè)化生產(chǎn)的研究。目前乳酸菌飼料添加劑的規(guī)模化生產(chǎn)需要解決3個問題，原料廉價易得，最好是廢棄的農(nóng)副產(chǎn)品;工藝低碳環(huán)保，盡量減少能源消耗和二次污染;操作簡便，不需添加外源物質(zhì)，如都符合就能生產(chǎn)出高密度的乳酸菌，為此研究者們不懈努力。劉曉紅等以玉米粉和麥麩等為固態(tài)基質(zhì)，對一株植物乳桿菌進(jìn)行固態(tài)混合發(fā)酵試驗(yàn)，培養(yǎng)結(jié)束后乳桿菌活菌數(shù)可達(dá)100億CFU/g;方芳等以玉米粉、豆粕和麥麩為基質(zhì)對保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌和嗜熱鏈球菌進(jìn)行固態(tài)混合發(fā)酵試驗(yàn)，40℃時得出最好發(fā)酵結(jié)果，各活菌數(shù)超過10億CFU/mL。許贛榮等明一種利用糖渣培養(yǎng)乳酸菌及生產(chǎn)乳酸活菌飼料的方法，以玉米淀粉制糖工業(yè)副產(chǎn)物糖渣為主要原料，添加麩皮和蛋白胨等物質(zhì)，采用固態(tài)分批液態(tài)分批或液態(tài)補(bǔ)料的方式，研制出液態(tài)培養(yǎng)活菌含量超過10億CFU/mL，固態(tài)培養(yǎng)活菌含量超過10億CFU/g的乳酸菌劑。然而對照規(guī)模化生產(chǎn)需要解決的3個問題，上述研究離目標(biāo)要求還有一定距離。在我國，每年都有數(shù)以萬t的菠蘿渣、羅漢果渣、燒仙草渣、馬蹄淀粉廢水及馬蹄渣等農(nóng)產(chǎn)品加工廢渣，量大且相對集中，對其進(jìn)行資源化利用的意義十分重大。研究植物乳桿菌對上述農(nóng)副產(chǎn)品廢渣的利用情況，同時發(fā)現(xiàn)一種利用馬蹄淀粉廢水及馬蹄渣生產(chǎn)乳酸菌飼料添加劑的新方法。

1材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌種

植物乳桿菌，實(shí)驗(yàn)室分離保存，標(biāo)記為LP199，菌劑為干粉狀，活菌含量400B/g。

1. 1. 2 農(nóng)副產(chǎn)品廢渣

菠蘿渣(菠蘿經(jīng)壓榨機(jī)壓榨取汁后的果渣)，羅漢果渣(鮮羅漢果經(jīng)浸提壓榨后的果渣，主要為羅漢果核)，燒仙草渣(燒仙草干草經(jīng)浸提后的草渣)，馬蹄淀粉廢水(馬蹄經(jīng)勻漿、去渣和流槽沉淀后的廢水)，馬蹄渣(馬蹄勻漿經(jīng)漿渣分離再作壓濾后之渣)。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 可資源化利用農(nóng)副產(chǎn)品廢渣的快速篩選

取0.40 g 植物乳桿菌菌劑，加入至1 000 mL滅菌氯化鈉注射液中，混勻，制得1億CFU/mL 的菌種液。將菌種液按1∶10 分別接種于下列試驗(yàn)編號的樣品中。

1 號: 450 g 菠蘿渣，加入450 mL 蒸餾水，置于1 000 mL廣口瓶中; 2 號: 450 g 羅漢果渣， 加入450 mL 蒸餾水， 均質(zhì)， 置于1 000 mL廣口瓶中; 3 號: 450g 燒仙草渣，加入450mL 蒸餾水，均質(zhì)，置于1 000 mL 廣口瓶中; 4 號: 900 mL 馬蹄淀粉廢水， 置于1 000mL廣口瓶中; 5 號: 450 g 馬蹄渣，加入450mL 蒸餾水，置于1 000mL廣口瓶中。密封置30 ℃發(fā)酵24 h，進(jìn)行感官、菌相鏡檢及pH 測定，其中pH 用檢定合格的pH 計測定。5個樣品同時另備一份，相應(yīng)編號為A、B、C、D 和E，進(jìn)行發(fā)酵前的感官、菌相鏡檢及pH 測定。選取發(fā)酵后色澤和氣味較好、革蘭陽性短桿菌較多且純及pH 較低的樣品作為植物乳桿菌可資源化利用的基質(zhì)。

1. 2. 2 植物乳桿菌LP199 對選用基質(zhì)營養(yǎng)成分利用的試驗(yàn)

對篩選出的基質(zhì)，重復(fù)1.2.1 中試驗(yàn)，檢測其發(fā)酵前后的總糖、蛋白質(zhì)、總酸( 以乳酸計) 、乳酸、脂肪、淀粉、粗纖維和膳食纖維等營養(yǎng)成分，并分析前后變化。相關(guān)方法根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB /T5009.8—2008、GB 5009.5—2010、GB/T 12456—2008、SN/T 2007—2007、GB/T 5009.6—2003、GB/T 5009.9—2008、GB/T 5009.10—2003 及GB/T 5009.88—2008進(jìn)行。對固體廢渣進(jìn)行氨基酸檢測，分析發(fā)酵前后變化。對氨基酸的檢測按國家標(biāo)準(zhǔn)GB /T5009.124-2003方法進(jìn)行。

1.2.3 選擇基質(zhì)生產(chǎn)乳酸菌劑的試驗(yàn)

試驗(yàn)前，現(xiàn)場取樣，測可溶性固形物、pH、鏡檢和菌落總數(shù)。可溶性固形物用手持式折光儀直接讀數(shù)，菌落總數(shù)按國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.2—2010方法檢測。試驗(yàn)時，將植物乳桿菌菌種液按1∶10 直接接入基質(zhì)中過夜進(jìn)行一級放大，再按同比例接種培養(yǎng)，發(fā)酵24 h，測鏡檢、感官、pH 及乳桿菌數(shù)，同時作對照試驗(yàn)。

2結(jié)果與分析

2. 1 可資源化利用的農(nóng)副產(chǎn)品廢渣快速篩選結(jié)果

利用植物乳桿菌LP199 對菠蘿渣、羅漢果渣、燒仙草渣、馬蹄淀粉廢水及馬蹄渣等進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果見表1。

試驗(yàn)所用菌種LP199，為一種植物乳桿菌，系革蘭陽性桿菌，分散排列，菌體大小( 0. 8～1. 0) μm×( 1. 0～2.0) μm。菌種LP1999 在菠蘿渣中未能占據(jù)主導(dǎo)地位，大量生長的是一種革蘭陽性鏈桿菌; 羅漢果渣發(fā)酵后總體菌量較少，并且酵液發(fā)臭; 燒仙草渣接種培養(yǎng)后呈現(xiàn)混合菌相，pH 未能明顯下降，且出現(xiàn)產(chǎn)氣和腐爛味; 因此上述3 種廢渣均不適合作為生產(chǎn)乳酸菌劑的基質(zhì)。馬蹄淀粉廢水和馬蹄渣發(fā)酵后，其pH 迅速下降，具有特殊發(fā)酵的酸香味，菌體主要為植物乳桿菌，故研究首先選取此2 種物質(zhì)作為培養(yǎng)植物乳桿菌的基質(zhì)。

2. 2 植物乳桿菌LP199 對馬蹄淀粉廢水和馬蹄渣營養(yǎng)成分的利用結(jié)果

將菌種LP199 接種于馬蹄淀粉廢水和馬蹄渣中，檢測其發(fā)酵前后總糖、蛋白質(zhì)及總酸等營養(yǎng)成分含量，結(jié)果見表2。

發(fā)酵后，馬蹄淀粉廢水和馬蹄渣總糖接近0，而總酸大幅增加。總酸成分主要為乳酸，馬蹄淀粉廢水中乳酸與總酸的比為82%，馬蹄渣中乳酸與總酸的比為98%，說明菌種LP199 是同型乳酸發(fā)酵，如此高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的乳酸足以抑制或殺滅其他細(xì)菌，為其免于對基質(zhì)的熱處理從而實(shí)現(xiàn)低碳發(fā)酵奠定基礎(chǔ)。

發(fā)酵前后，蛋白質(zhì)、脂肪和淀粉的含量沒有明顯變化，提示菌種LP199 與其他大多數(shù)乳酸菌一樣，缺乏這些物質(zhì)的分解酶系，其生長所需因子主要來源于馬蹄淀粉廢水和馬蹄渣中已有的營養(yǎng)物質(zhì)，同時也說明馬蹄淀粉廢水和馬蹄渣的利用前景廣闊。試驗(yàn)同時檢測的還有馬蹄渣發(fā)酵前后氨基酸的含量，結(jié)果見表3。

馬蹄渣經(jīng)菌種LP199 發(fā)酵后，其氨基酸含量由4.400 g /100 g 增加至5.743 g /100 g，總量增加30. 50%。氨基酸中，只有胱氨酸減少，其余全部增加，增加超過50%的有谷氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸和精氨酸，其中后5 種氨基酸為畜禽必需氨基酸。氨基酸含量的變化反映出菌種LP199 復(fù)雜的生理代謝作用，因?yàn)榘被岜旧砭褪侨樗峋牧己玫孜铮园l(fā)酵后氨基酸含量的增加可能來源于菌體的增加，表明菌種LP199 是一種優(yōu)良的單細(xì)胞蛋白。

2.3 馬蹄淀粉廢水及馬蹄渣生產(chǎn)乳酸菌劑試驗(yàn)結(jié)果

將菌種放大一級后再分別接種于馬蹄淀粉廢水和馬蹄渣中，自然環(huán)境條件下密封放置，試驗(yàn)結(jié)果見表4。試驗(yàn)于2012 年12 月23 日和2013 年2 月1 日在宏源公司生產(chǎn)現(xiàn)場進(jìn)行2 次，日平均氣溫20 ℃ ～15 ℃，結(jié)果取2 次試驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均數(shù)。

從表4 可見: 馬蹄淀粉廢水和馬蹄渣基質(zhì)中，含有一定的雜菌，數(shù)量超過100 萬CFU/( mL·g-1) ，主要是一些革蘭陽性小球菌， 如不接種菌種LP199，24 h 后，該菌會大量繁殖，菌體密度超過10 億CFU/( mL· g-1) 。而接入10% 的菌種LP199 一級放大菌液后，菌種LP199 的生長數(shù)量居于主導(dǎo)地位，培養(yǎng)液中幾乎全為植物乳桿菌，由于沒有其他外源菌，表中乳桿菌的數(shù)量就是菌種LP199 的數(shù)量，它在馬蹄淀粉廢水中的純度是91. 70%，在馬蹄渣中的純度幾乎是100%，而且密度較高，活菌數(shù)超過10億CFU/(mL·g-1)。

目前由于我國還沒有乳酸菌菌劑的國家或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，如以中華人民共和國農(nóng)業(yè)部光合細(xì)菌菌劑的標(biāo)準(zhǔn)作為生物菌劑的判定依據(jù)，可發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)得到的乳酸菌菌劑數(shù)量的雜菌率均滿足其要求，是一種優(yōu)良的生物飼料添加劑，特別是馬蹄渣中還含有大量的膳食纖維(見表2)，更凸顯其作為飼料添加劑的優(yōu)越性。

3討論

研究發(fā)現(xiàn)一種利用馬蹄淀粉廢水和馬蹄渣生產(chǎn)植物乳桿菌飼料添加劑的新方法，該方法具有原料廉價易得、工藝低碳環(huán)保和操作簡便可行等特點(diǎn)，由此生產(chǎn)的生物飼料添加劑可廣泛應(yīng)用于畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖。

植物乳桿菌屬于乳桿菌屬，其營養(yǎng)要求比較復(fù)雜，需要氨基酸、核酸衍生物、維生素和可發(fā)酵的糖等，因此并非所有的農(nóng)副產(chǎn)品廢渣都可被其利用，如菠蘿渣、羅漢果渣和燒仙草渣等，廢棄柑橘和柿子則更難被利用。研究發(fā)現(xiàn)，馬蹄淀粉廢渣是培養(yǎng)植物乳桿菌LP199 的優(yōu)良基質(zhì)。馬蹄淀粉加工過程中產(chǎn)生的廢水和廢渣， 可溶性固形物達(dá)1.50%～2.00%，實(shí)際上可看作是馬蹄勻漿的上清液( 因廢渣含水量也達(dá)到79.60%) ，其中蘊(yùn)含著豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，非常適合植物乳桿菌的生長，植物乳桿菌接種至馬蹄淀粉的廢水和廢渣后，能迅速增殖，產(chǎn)生大量的乳酸，pH 低于4.0，抑制和殺滅其他微生物，使雜菌率控制在10%以內(nèi)，這一培養(yǎng)特性可用于生物飼料添加劑的工業(yè)化生產(chǎn)，因其不需添加任何外源物質(zhì)，不需任何熱處理措施，甚至可做到0排放。

與馬蹄淀粉廢水相比，馬蹄渣作為基質(zhì)更有利于植物乳桿菌LP199 的增殖，利用后不僅活菌含量更高，且菌物更純，純度幾乎可達(dá)100%。有趣的是，馬蹄渣接種植物乳桿菌LP199培養(yǎng)后，其氨基酸含量增加30. 50%，這可能是由于菌體蛋白的增加造成的，這一結(jié)果表明菌體本身可作為高質(zhì)量的單細(xì)胞蛋白。然而由于氨基酸的總含量不高，因此其應(yīng)用意義更多地在植物乳桿菌的大量增殖足以達(dá)到發(fā)揮對動物的益生作用，同時通過改善馬蹄渣的營養(yǎng)成分，增加其適口性，從而增加其作為生物飼料添加劑的性價比。

采用一級放大，二級10%的接種量，自然環(huán)境條件下直接培養(yǎng)，無需任何特殊的工藝，即可將馬蹄淀粉廢水和馬蹄渣變?yōu)榛罹砍^10億CFU/(mL·g-1)的乳酸菌飼料添加劑。由于乳酸菌對環(huán)境敏感，不易保存，因此還需對其活性保存條件作進(jìn)一步研究。

以年產(chǎn)2 000 t 馬蹄淀粉來計，馬蹄淀粉廢水和馬蹄渣量將分別約達(dá)到1.20 萬和0.45 萬t，其量大，且相對集中，因此對其進(jìn)行資源化利用生產(chǎn)乳酸菌飼料添加劑前景廣闊，馬蹄濕渣中還含有13.50 g /100 g 的膳食纖維，折合干物質(zhì)基礎(chǔ)含量為67.60 g /100 g，這將大幅增加其作為生物飼料添加劑的潛在價值。