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乳酸菌微進化的研究進展

2017-02-01 21:47:38      點擊:

乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)是一類革蘭氏染色呈陽性,發酵碳水化合物以乳酸為主要代謝終產物的兼性厭氧細菌的總稱,共包含有乳桿菌屬、乳球菌屬、鏈球菌屬、片球菌屬、明串珠菌屬、腸球菌屬等43個屬,這些屬又可劃分為373個種和亞種。乳酸菌發酵歷史悠久,廣泛應用于乳制品、肉制品、青貯飼料、谷物和果蔬等的生產加工中,在人類生產、生活中發揮著重要作用,是食品工業中重要的微生物。目前,已發現乳酸菌可以棲居于人和動物腸道及其他器官中,尤其是益生乳酸菌能夠調節腸道微生態平衡,具有抗腫瘤、降膽固醇、降血壓、延緩衰老等功效[1]。

隨著分子生物學理論和生物技術的發展,大量基因組的完成以及功能基因的不斷破譯為乳酸菌的深層次研究提供了新基礎,研究人員不斷開發新的分子生物學方法和手段對乳酸菌分類鑒定、基因功能及其系統發育和種群進化進行分析研究。乳酸菌微進化研究是從分子水平上了解乳酸菌的系統發育關系并重塑其進化歷程,為揭示其生物學功能的形成和進化機制提供遺傳學基礎,有利于將其更好的應用于食品工業中。

1 乳酸菌微進化的理論基礎

生物進化的研究體現在兩個層次上:宏進化(macroevolution)和微進化(microevolution)。微進化,也稱“種內進化”,指的是同一生物種內或近緣物種之間的進化,是一個導致種內分化的過程,著重于研究基因對性狀的影響以及選擇壓力對基因變異的作用[2]。微進化中基因的遺傳變異通常具有可明確闡述的分子與遺傳基礎,可以追溯其發生發展的過程,有規律可循,因此是生物學領域關注的焦點之一。

1.1 微進化的動力

現代達爾文主義理論將生物的進化定義為群體內基因頻率的改變,因此,從分子水平上來說,對進化的研究,即對微進化的研究,就是對某一群體的等位基因頻率的動態變化的研究[3]。微進化的動力包括:基因突變、基因重組、遺傳漂變和自然選擇[2]?;蛲蛔儼ê塑账岬奶娲?、插入/缺失、重組和基因轉換,是進化的絕對動力;基因重組在一定程度上可以增加遺傳變化,但不會改變等位基因頻率;遺傳漂變對中性突變的突變子的固定方面發揮著重要作用,尤其在小群體中;自然選擇是指自然環境對基因變異的選擇作用,正向選擇淘汰群體中的變異,而平衡的選擇增加其變異[4]

1.2 乳酸菌的遺傳變異機制

遺傳變異的穩定遺傳是細菌最終適應新環境的基礎。目前發現的乳酸菌的遺傳變異機制有兩大類:一類是基因水平轉移(Horizontal Gene Transfer,HGT),乳酸菌基因組中基因水平轉移(HGT)是個普遍的進化事件[5]。大量證據顯示乳酸菌為了快速適應新環境,可通過HGT從環境中獲得一段遺傳物質以期適應新環境而生存[6, 7]。另一方面,乳酸菌在微進化中不斷獲得新基因片段的同時,還具有將“無用”基因片段不斷鈍化、缺失的能力,以維持其遺傳物質的相對平衡。2006年,Makarova等[8]對9株乳酸菌基因組分析發現,在營養豐富的環境中,合成途徑中相關酶類有不同程度的缺失,這種突變不斷積累,最終形成了不同的營養缺陷型乳酸菌菌株。這種基因鈍化、缺失的現象不僅出現在德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)、格氏乳桿菌(Lactobacilus gasseri)和約氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii)亞群中,也頻繁出現在基因組容量較大的干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)和植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)中[5]

另一類就是其自身基因的變異,包括點突變(不導致編碼氨基酸變異的同義突變或導致編碼氨基酸變異的非同義突變)、基因重組、短重復序列變異等[2]。通過非同義突變率(dNKA)和同義突變率(dSKS)的比值可判定一個突變位點的選擇壓力(dN/dS<1.0表示負向選擇;dN/dS=1.0為中性進化;dN/dS>1.0為正向自然選擇)[9, 10]。2012年,Bachmann等[11]對3株乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的遺傳穩定性進行研究,結果顯示3株菌在乳中連續培養1000代后,其基因組中分別發生了4、6和21處點突變,包括編碼氨基酸合成、轉運和DNA錯配修復mutL基因等出現了SNP突變,其dN/dS值均大于1,顯示出菌株為適應新環境正經歷著正向選擇壓力,基因組的變異是菌株為了適應從植物體到乳的生境過渡而經歷的進化過程。

2 乳酸菌微進化的研究方法

乳酸菌為原核生物,其微進化的研究,只能借助于保守序列的比較研究,通過高分辨率的標志區分不同菌株的種群結構,再根據這些變異的種群分布揭示細菌可能的微進化歷程,為了揭示未知的細菌種群結構變異,科學家們已經發展了很多DNA指紋分析技術和基于核酸序列的分析手段。

2.1 基于DNA指紋圖譜的微進化研究方法

隨著分子生物學的不斷發展,大量分子分型技術和方法被引入到乳酸菌的分型研究中,比如隨機擴增多態DNA技術(Randomly Amplified Polymorphic DNA,RAPD)[12]、變性梯度凝膠電泳標記技術(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,DGGE)[13]、限制性片段長度多態性分析技術(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)[14]、擴增片段長度多態性分析技術(Amplified Fragment Length Polymorphism,AFLP)[15]以及脈沖場凝膠電泳技術(Pulsed-Field Gel Electrophoresis,PFGE)[16, 17]等技術,都是基于電泳技術,以不同菌株基因組DNA圖譜的差異為依據進行乳酸菌的分型研究。但是,這些技術分辨率較低、重現性低,在親緣關系較近菌種的鑒定中實用性越來越少,并且僅局限于實驗室的條件下,不能夠實現數據的交流和比較。因此對于近緣菌種的分析,需要一個更方便可靠且分辨率更高的方法。

2.2 基于DNA序列差異的微進化研究方法

為了進一步深入研究細菌的基因型以及微進化,出現了一系列基于DNA序列差異的分析技術與方法。早期的有基于單個基因的16S rRNA基因間隔區(Intergenic Spacer Region,ISR)[18]、重復基因外回文序列分析技術(Repetitive Extragenic Palindromic Sequences,Rep-PCR)等;隨后,基于多個看家基因部分片段的核苷酸序列分析被用于乳酸菌的基因分型研究[19],如多位點可變數目串聯重復序列分析技術(Multiple-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis,MLVA)[20]、多位點序列分型技術(Multi-locus Sequence Typing,MLST)[16, 21]等。其中MLST一度成為最成熟和最具標準化的分析手段,因其簡便快速、重復性強和分辨率高等優點,被廣泛應用于乳酸菌遺傳多樣性、種群結構及微進化的研究中。

2004年,de Las Rivas等[22]首次利用MLST技術對18株分離自酒類酒球菌(Oenococcus oeni)的5個管家基因進行了多位點序列分型,研究顯示重組是Oenococcus oeni菌株遺傳多樣性增加的主要原因。2007年,Cai等[23]采用6個等位基因的MLST技術分析了40株分離自植物、人腸道、人血液以及不同地區干酪中L. casei,結果表明分離自不同環境中的菌株由于特定的環境使其發生了特定的遺傳進化,其遺傳特性與分離環境相關,并提出乳酸菌在不同自然環境選擇的作用下經歷的進化過程是可追溯的。2011年,為了驗證嬰兒腸道中Bifidobacterium longum subsp. longum是否來源于母親,Makino等[24]采用MLST技術研究了8對母親和嬰兒腸道的207株Bifidobacterium longumsubsp. longum。研究發現分離株的聚類大都以不同的家庭為單位,表明該菌株可能由母親傳遞給嬰兒。2013年,Dan等采用MLST技術對分離自中國和蒙古國的自然發酵乳制品中的50株乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)進行了種群結構分析,結果表明Leuconostoc lactis存在種內重組現象,但其明顯地形成了高度克隆的兩個亞群[25]

越來越多的研究表明,在遺傳多樣性分析方面,MLST是行之有效的技術手段[26]。研究人員不斷利用MLST技術鑒定得到許多新的物種,如L. delbrueckii subsp. sunkii L. delbrueckii subsp. jakobsenii的發現[27, 28]。在種群結構和微進化分析方面,MLST也顯示出來較大的潛力,可檢測種群內頻繁的重組現象,追溯不同生境下各種群結構的進化歷程,但遺憾的是,相較于全基因組來說,MLST位點所攜帶的遺傳信息十分有限,其揭示的遺傳進化關系大都局限于籠統的種群結構分群信息,給微進化的分析帶來一定難度。

近年來,隨著高通量測序技術的不斷出現,基于全基因組范圍內DNA序列差異分析的全基因組測序技術(Whole-genome sequencing)不斷用于細菌群體遺傳學和微進化的研究[29],以其低成本、高通量和耗時短等特點為乳酸菌微進化、代謝多樣性及其功能基因的研究注入了強勁的驅動力。

3 基因組重測序技術及其在乳酸菌微進化中的應用3.1 基因組重測序技術概述

基因組重測序技術(Whole-genome re-sequencing)是指對已知基因組序列的物種進行不同個體的基因組測序,在此基礎上檢測個體或群體的基因差異或結構差異,進而進行遺傳進化分析[30]。其原理是將重測序結果與已知序列比對,尋找單核苷酸多態性位點(Single Nucleotide Polymorphisms,SNP)、插入缺失位點(Insertion/Deletion,InDel)、結構變異位點(Structure Variation,SV)及拷貝數變化(Copy Number Variations,CNV),發現大量基因差異,實現遺傳進化分析及重要性狀候選基因的預測。

3.2 基因組重測序技術在乳酸菌中的應用

2001年完成的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis subsp. lactis IL1403)全基因組測序是乳酸菌的破冰之作,隨后進入乳酸菌基因組測序的高峰階段,我國也于2008年完成第一株L. casei Zhang的全基因組測序[31]。到目前為止,已有80%以上的乳酸菌種完成了全基因組序列測定,陸續破譯的乳酸菌基因組不僅解析了相應的生物代謝途徑,同時為從全基因組水平分析乳酸菌的進化歷程提供了參考序列。

2009年,Cai等[32]L. casei ATCC 334基因組序列為參考菌株,對21株分離自植物、人體以及不同地區干酪中的L. casei進行了全基因組微陣列的比較基因組雜交分析(comparative genome hybridization,CGH),結果顯示與參考菌株相比,分離自不同環境中的L. casei菌株具有各自獨特的功能基因,說明這些菌株在適應不同環境的同時,基因發生不同程度的插入或缺失,這與Cai等2007年采用MLST技術分析所得結果一致,不僅驗證了MLST方案的準確性,也說明基因組重測序技術是研究乳酸菌微進化的行之有效的技術手段。

近年來,隨著基因組測序技術不斷更新,測序通量顯著遞增,測序成本銳減,使得大批量、大規模測定乳酸菌的某一類群成為可能,越來越多的學者嘗試著從全基因組角度解析乳酸菌的群體遺傳與物種分化過程。2013年,Smokvina等以L. casei Zhang、ATCC334、BL23為參照序列,采用基因組測序技術完成了34株L. casei分離株的基因組重測序,系統分析了L. casei不同菌株糖代謝能力的差異[33]。結果顯示,L. casei包含多個磷酸烯醇式丙酮酸運輸系統(Phosphoenolpyruvate Transport System,PTS),相對于L. johnsoniiL. acidophilus多出10-20個完整的PTS系統,使得這些菌株可利用更多種類的糖,指示出該菌可適應更多的生境。進一步分析乳源L. casei分離株編碼的PTS系統相對較少,推測可能是適應了乳中營養環境,鈍化、丟棄了長期不使用的部分轉運系統。同時,Toh等[34]通過對L. casei、L. paracaseiL. rhamnosus基因組比較分析時也發現類似的現象,這些充分說明了L. casei為適應不同環境而發生了定向的微進化歷程。

2014年,內蒙古農業大學的孫志宏[35]采用基因組重測序技術完成了146株Lactobacillus模式菌株基因組的測定,結合公共數據庫中已完成的3株Lactobacillus模式菌株的全基因組序列,站在全基因組的角度對整個乳桿菌屬各種系的進化關系進行了詮釋。該研究建立了含有72個基因的Lactobacillus核心基因集,深入解析了149株Lactobacillus模式菌株的種系發育情況和物種分化歷程,結果表明Lactobacillus基因組遺傳多樣性遠高于傳統細菌分類學定義中的“科”,而且以72個核心基因為依據可將乳桿菌模式菌株分為2個大的進化分支:Oenococcus、Pediococcus、WeissellaLeuconostocLactobacillus屬于一個進化分支Lactobacillus complex,而屬于同一祖先分化的LactococcusStreptococcusEnterococcus處于Lactobacillus complex分化前的另一個分支。

對于每個生物體來說,基因組包含了整個生物體的遺傳信息。上述研究結果均表明,全基因組測序技術能夠完整地反映基因組DNA上的遺傳信息,進而比較全面地揭示基因組的復雜性和多樣性,成為研究乳酸菌微進化的強有力的技術手段。

4 乳酸菌微進化的研究意義

細菌微進化研究反應了環境對種群進化的塑造和影響。乳酸菌是重要的食品工業微生物,其遺傳背景和進化歷程是研究、開發乳酸菌的首要基礎。研究乳酸菌的微進化機制,首先可以對乳酸菌進行進化溯源,這有利于闡明乳酸菌各種屬間的親緣及進化關系,重建乳酸菌系統發育樹,從而為建立針對乳酸菌的更精確、快速的分類鑒定體系提供理論依據。其次,隨著益生菌概念的提出,乳酸菌的益生特性不斷被驗證,但仍有許多未知的功能尚未被發現,研究乳酸菌的微進化機制,可以從分子水平上解析其生物學功能的形成和進化機制,找到益生特性的關鍵基因,進而針對相關基因開展基礎研究,并拓寬乳酸菌的應用范圍,這有利于深入發掘國內豐富的乳酸菌資源。同時,在乳酸菌的抑菌性及工業生產中發酵特性等方面的研究中,乳酸菌的微進化研究也可以為發酵劑菌株篩選與制備提供強有力的理論基礎,篩選出具有我國自主知識產權的優良菌種,并使其更好的應用于食品工業。這些均對我國食品工業的長遠發展有著相當重要的戰略意義。此外,乳酸菌微進化作為生物進化的一部分,其研究可以極大的豐富現代進化理論,還可以從基因突變率等方面對傳統的進化模型如分子鐘[4]等進行驗證。

5 展望

縱觀現有的微進化研究方法,僅以單個基因為研究對象的16S rRNA基因序列同源性研究,并不能真實的反映乳酸菌在自然界各種生境中的進化關系,而基于多個管家基因位點的核酸序列分析方法,如MLST技術,雖然具有分辨率高、數據可靠、重復性好,不同實驗數據便于比較,有利于全球范圍內菌株間的數據標準化等諸多優點,但此類方法畢竟只局限于整體基因組上的個別位點,這很有可能漏掉十分關鍵的遺傳信息,導致分析所構建的種群結構與真實的存在過多偏差。最近幾年高通量測序技術的迅猛發展,使大規模測定細菌全基因組序列成為可能,研究學者可綜合利用群體遺傳學、微生物學、生物信息學等方法,對完整的基因組數據進行深度挖掘,全面、系統地了解乳酸菌基因組的結構和組成,從而為乳酸菌微進化機制的研究開辟新思路。

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