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導讀

大腸桿菌Nissle 1917(EcN)(血清型為06：K5：H1)是一株被德國醫生Alfred Nissle在一戰期間發現并分離得到的無致病性的革蘭氏陰性益生菌 。EcN的益生功能與其對腸道微生物的調控和腸道內細胞因子引起免疫反應存在關聯。EcN通過調控抗菌肽的表達，增加免疫球蛋白A(IgA)和黏蛋白的分泌以及促進抗炎癥免疫反應，在腸道中發揮重要的免疫功能。EcN也能通過上調緊密連接蛋白閉鎖小帶的表達以及促進緊密連接蛋白上調和再分布 ，對增強豬腸上皮細胞的緊密連接和提高黏膜屏障具有重要的作用?？诜﨓cN能顯著降低斷奶仔腹豬瀉率和競爭性阻礙沙門氏菌入侵，也能有效預防產毒素大腸桿菌的感染。由此可見，EcN對提高動物腸道免疫功能、保護腸道屏障具有重要的作用。益生菌在腸道內存活并黏附于腸道上皮細胞表面，是其發揮益生作用的前提和基礎。因此，本試驗旨在探明EcN的生長特性，耐酸、耐膽鹽和耐熱的性能，對豬腸上皮細胞黏附性能，以及對致病菌的抑菌效果，為EcN在動物生產中的應用提供參考意義。

1材料與方法

1.1 EcN生長曲線的測定和菌液制備

EcN菌株購自德國微生物菌種中心(編號為DSM 6601)。大腸桿菌K88菌株購自中國獸醫藥品監察。采用比濁法繪制EcN和大腸桿菌K88生長曲線，以培養時問(0~30 h)為橫坐標，以對應的通過測定LB液體培養基培養菌液的600 nm吸光度值(OD600nm)，OD600nm為縱坐標繪出EcN的生長曲線。采用LB液體培養基培養EcN和大腸桿菌K88菌液，用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)將菌液調整濃度約為1.0x108CFU/mL，用于體外抗逆性能、豬腸上皮細胞黏附性能和抑菌效果檢測。

1.2 IPEC-J2細胞的培養

豬空腸上皮細胞IPEC-J2細胞來自西南大學動物科技學院實驗室的凍存細胞。將復蘇細胞置于培養瓶中，加入5 mL DMEM 完全細胞培養液(含5％胎牛血清+1％雙抗)，置于37℃ 5％ CO2培養箱中培養。待貼壁率達85％時，胰酶消化，調整濃度約為2.0x105個/mL，置于六孔培養板中繼續培養，生長至單層后進行后續試驗。

1.3 體外抗逆性能檢測

1.3.1 耐酸和耐膽鹽

取等體積EcN菌液分別置于pH 1.5、2.0和2.5的模擬胃液中，以pH 7.0模擬胃液為對照。再取等體積EcN菌液分別置于豬膽鹽濃度為0、0.30％ 、0.60％和0.90％的LB液體培養基中，每組3個重復。胃酸組和膽鹽組置于37℃ 200 r/min恒溫振蕩器中分別培養3和24 h。處理后與處理前細菌總數比值的百分數為EcN存活率。

1.3.2 耐熱

取4份9 mL滅菌生理鹽水于試管中并預熱至80℃ ，再分別加入1mL菌液，保溫30、40、50和60 S后，迅速冷卻，對不同保溫時間組菌液按10倍梯度進行稀釋，吸取100 μL最佳稀釋濃度菌液均勻涂抹于LB固體培養基上，置于37℃ 培養箱中培養24 h后菌落計數，每組2個重復。調節水溫至70、65℃ ，重復上述試驗，用1.3.1中的計算方法計算EcN存活率。

1.4 IPEC-J2細胞黏附和抑菌試驗

試驗組取2 mL DMEM 不完全細胞培養液(不含雙抗)和1 mL各時期(遲緩、對數、平穩和衰亡期)EcN菌液加入IPEC-J2細胞，以等體積無菌PBS替代EcN菌液作為對照組，每組重復3孔，置于37℃ 5％ CO2培養2 h后，PBS漂洗5次，自然晾干，甲醇固定20 min，革蘭氏染色，油鏡下隨機選取25個視野，拍照和計數100個細胞上黏附的EcN菌數，細胞黏附細菌數與加入細菌總數比值的百分數為EcN黏附率。

試驗組取EcN菌液500 L與IPEC-J2細胞預先培養2 h后，再加入大腸桿菌K88菌液500 L和1 mL DMEM 不完全細胞培養液，以未加EcN的大腸桿菌K88菌液作為對照組。37℃ 5％ CO2繼續培養2 h后，PBS漂洗5次，裂解細胞并10倍梯度稀釋裂解液，再均勻涂抹于選擇性培養基紫紅膽汁瓊脂(VRBA)上，平板計數。每組重復4孔，取平均值。按以下公式計算EcN對致病菌的黏附抑制率：黏附抑制率(％)=100x(對照組一試驗組)/對照組。

取100μL大腸桿菌K88菌液均勻涂抹于瓊脂培養基上，于無菌超凈臺上室溫晾干，再用牛津杯(直徑為8 mm)進行打孔。取200 μL EcN菌液置于瓊脂板上孔中，37℃培養24 h，測定抑菌圈直徑，做3個重復，取平均值判定抑菌效果。

1.5 β-防御素-2和Toll樣受體水平的檢測

試驗分為4組，試驗組分別取l mL EcN(EcN組)、大腸桿菌K88(大腸桿菌K88組)及EcN+大腸桿菌K88混合液(體積比1：1，EcN+大腸桿菌K88組)置于IPEC-J2細胞已長至單層的六孔培養板中，另以等體積PBS作為對照組，再加入2 mL DMEM不完全細胞培養液培養3 h后，PBS漂洗5次，胰酶消化后轉至1.5 mL離心管內，4℃12 000 r/min離心5 min，棄上清，再漂洗、離心棄上清，然后加入1 mL蛋白質裂解液，離心10 min取上清，采用蛋白質印跡(Western blot)法檢測β-防御素-2和Toll樣受體水平。

1.6 數據統計方法

采用Excel 2007軟件進行數據整理，采用SAS 9.1.3軟件的GLM 程序進行單因素方差分析，組間顯著性分析采用Duncan氏法進行多重比較，結果以平均值和標準誤(SEM)表示。

2結果與分析

2.1 EcN生長曲線

EcN生長曲線如圖l所示。接種4 h后呈快速上升趨勢，顯示其進入對數生長階段，培養10 h后逐漸進入穩定期，18 h后逐漸出現緩慢下降趨勢，24 h后此趨勢較明顯，逐漸進入衰亡階段。

2.2 EcN體外抗逆性能

EcN耐酸試驗結果如表1所示。隨模擬胃液pH的降低，EcN存活率顯著下降(P<0.05)。當pH為2.5時，EcN存活率為30.26％，較對照組減少51.58％。pH為2.0和1.5時，EcN存活率分別為17.69％ 、10.44％ ，強酸性環境抑制EcN的生長。

EcN耐膽鹽試驗結果如表2所示。對照組存活率為84.95％，隨膽鹽濃度增加，EcN存活率顯著下降(P<0.05)。膽鹽濃度為0.30％時，其存活率迅速下降至27.34％ 。當膽鹽濃度從0.30％增加至0.90％時，存活率下降趨勢較平緩。而膽鹽濃度在0.60％和0.90％時，EcN存活率分別為21.03％ 、15.21％。高膽鹽環境會抑制EcN的生長。

EcN溫度耐受試驗結果如圖2所示。隨水浴溫度升高和保持時間增加，EcN存活率逐漸降低。不同溫度保持30、40、50和60 S，在80℃ 時EcN存活率分別為15.86％、11.01％、5.29％和2.20％，除50和60 S差異不顯著(P>0.05)外，其余時間點差異顯著；在70℃ 時EcN存活率分別為59.03％、49.78％、43.61％ 和30.40％ ，各時間點差異顯著(P<0.05)；在65℃ 時EcN存活率分別為80.18％ 、73.57％ 、60.79％ 和49.34％ ，各時間點差異顯著(P<0.05)，存活率高于70和80℃。

2.3 EcN對IPEC-J2細胞的黏附作用

以測定的EcN生長曲線作參考，選用培養2、8、16和26 h的EcN，分別代表其遲緩期、對數期、穩定期和衰亡期4個生長階段，進行后續試驗。

EcN對IPEC-J2細胞的黏附作用結果如圖3和表3所示。不同生長階段的EcN對IPEC-J2細胞黏附率差異顯著(P<0.05)。以對數期EcN的黏附性能最佳，其每100個細胞黏附細菌數為3 056個，黏附率達33.96％ ；其次是穩定期，每100個細胞黏附細菌數為2 043個，黏附率達22.70％；遲緩期和衰亡期的黏附性能分別居于第3和第4，每100個細胞黏附細菌數分別為1174、661個，黏附率分別達13.04％ 、7.34％。

2.4 EcN對大腸桿菌K88的抑制作用

EcN對大腸桿菌K88的黏附抑制試驗結果如表4所示。EcN對大腸桿菌K88的黏附抑制率達到87.84％。抑菌試驗測得抑菌圈直徑為4.73 mm。結果表明，EcN對大腸桿菌K88具有良好的抑制效果。

2.5 EcN對IPEC-J2細胞β-防御素-2和Toll樣受體4水平的影響

EcN對IPEC-J2細胞β-防御素-2和Toll佯受體4水平的影響如圖4所示 對照組β-防御素-2水平顯著低于EcN 組和EcN+人腸桿菌K88組(P<0.05)，而 大腸桿菌K88組差異不顯著(P>0.05)，對照組Toll樣受體4水平顯著低于其他3組(P<0.05)。EcN組的β-防御素-2和Toll樣受體4水平低于EcN+大腸桿菌K88組，但差異不顯著(P>0.05)。此外，大腸桿菌K88組β-防御素-2和Toll樣受體4水平略低于EcN組和EcN+大腸桿菌K88組，但差異均不顯著(P>0.05)。

3討 論

3.1 EcN的體外抗逆性能

研究表明，EcN擁有6種獨特的鐵攝取系統能產生鐵螯合劑[腸菌素(enterobactin)、沙門菌螯鐵蛋白(salmochelin)、耶爾森桿菌素(yersiniabactin)、產氣菌素(aerobactin)、枸櫞酸鐵轉運系統(ferric dicitrate transport system)和楚血紅素轉運位點(the chu heme transport locus)]，攝取環境中的鐵離子(Fe3+)，用于代謝時能量的產生。而中性偏酸性條件更有利于EcN鐵攝取系統產生4種鐵螯合劑(enterobactin、salmochelin、aerobactin和yersiniabactin) 。由此推測，中性偏酸性環境更適宜EcN生存。雖然本試驗EcN存活率隨模擬胃液pH的降低而降低，但仍保持一定的存活，可見EcN對胃酸環境具有一定的耐受能力。豬胃內pH一般在2.0～3.5，飼糧變化會使胃酸pH在1.5～5.0波動，試驗結果顯示，在pH 2.5的模擬胃液中EcN也能存活，提示其能通過胃酸環境，進入腸道發揮益生作用。EcN除需要耐受胃酸環境外，還應耐受腸道中膽鹽形成的高滲透壓環境。豬腸道內膽鹽含量一般在0.03％～0.50％內波動，而本試驗顯示高膽鹽濃度(0.90％)環境下的EcN也依然能存活，可見EcN對腸道中的膽鹽環境也具有一定的耐受能力。此外，EcN在高溫環境中也能保持存活，表明其對溫度具有一定的耐受能力。關于益生菌耐酸、耐膽鹽、耐熱性能的具體機制，Hatice等研究發現，乳酸菌能產生胞外多糖，能耐受較低的pH和高膽鹽環境，Turpin等從分子水平發現益生菌乳酸片球菌(P.acidilactici)存在多種與耐酸、耐膽鹽、耐熱相關基因，如熱休克蛋白(groEL)基因、D-丙氨酸轉移酶(dltD)基因、clpL(一種ATP酶)基因和膽汁酸水解酶(bsh)基因等。因此，關于益生菌EcN耐受強酸高膽鹽高溫環境是否也存在上述相關或者其他潛在機制，還有待進一步研究。

3.2 EcN的黏附性能和抑菌性能

本試驗對比研究了4個時期的EcN對IPEC-J2細胞黏附能力的大小，其黏附效果以對數期最佳。熊濤等發現Caco-2細胞黏附羅伊氏乳桿菌數隨菌齡增大呈先增后減的趨勢。這提示EcN能良好地黏附于IPEC-J2細胞表面可能與其生長階段存在關聯。菌毛是細菌附著于動物消化道黏膜上皮細胞表面的重要結構，EcN 自身基因組編碼的FlA、FlC和卷曲菌毛能幫助其定植于IPEC-J2細胞上，并形成生物被膜抵御致病菌入侵。若缺乏FlC菌毛和鞭毛的表達，則會降低黏附性能和削弱對沙門氏菌入侵的抑制作用。也有文獻報道，EcN通過FlC菌毛調控對細胞的黏附作用以及對致病菌的抑菌作用。EcN誘導IPEC-J2細胞分泌β-防御素-2和促進T細胞中Toll樣受體4的表達，對抑制病原菌入侵和減輕腸道炎癥具有重要作用，同時EcN誘導β-防御素-2的分泌可能與鞭毛存在關聯；若EcN缺失編碼Flc菌毛和鞭毛基因，黏附率分別降低99.9％和50.0％，同時降低抑菌能力。此外，EcN在IPEC-J2細胞上黏附和生長期間會形成鞭毛，其鞭毛長度和數量隨培養時間的增加而增加 。由此可見，EcN良好地黏附于細胞表面發揮益生作用，Flc菌毛和鞭毛起著重要的作用。本試驗關于EcN誘導IPEC-J2細胞對β-防御素-2和Toll樣受體4的表達以及黏附作用機理只作了初步探究，而更深層次的黏附性能和抗菌機制仍需要進一步研究。

本試驗中，用大腸桿菌K88感染預先與EcN培養一段時間的IPEC-J2細胞，發現EcN對大腸桿菌K88黏附抑制率達87.84％。Boudeau等 副先將IPEC-J2細胞與EcN預先培養一段時間后再加入致病性大腸桿菌進行培養和直接將2種菌同時加入IPEC-J2細胞進行培養，對比研究EcN對致病性大腸桿菌的抑制作用，結果發現前者的抑制率為97.2％ ～99.9％ ，后者為7.0％ ～99.9％。Klete等 和Malchow等 也報道了預先將EcN與IPEC-J2細胞培養，能降低致病性大腸桿菌對細胞的感染機率，并影響致病菌對細胞的黏附和侵襲能力，而將EcN與沙門氏菌同時加入時，僅減少沙門氏菌入侵率為70％。推測EcN對細胞的黏附作用以及其生理功能的發揮可能存在時間效應。研究表明，增加EcN與細胞的預先培養時間有利于抑制病原菌的入侵，同時提高EcN的劑量，抑制效果更好。EcN預先培養和較高劑量使用也有利于提高腸道黏蛋白mRNA的表達水平。綜上研究，EcN制劑在生產實踐中盡早并高劑量使用，可能會更好的發揮益生作用。

本試驗只對EcN相關機理只作了初步的探索，關于EcN黏附機理和對致病菌黏附抑制作用以及抗逆性能的研究，還需要從分子水平進行更深入的探索。

4結 論

① EcN對豬腸上皮細胞黏附效果以對數期最佳，并對致病菌大腸桿菌K88存在較強的抑制作用。

② EcN面對高酸、高膽鹽環境也呈現一定的抗逆性能，有利于其在胃腸道內發揮生理作用。