（3） 飼養管理

代謝試驗在重慶市畜牧科學院雙河實驗基地進行，所有試驗豬采用代謝籠單獨飼養，預試期3 d，正試期4 d。粉料飼喂，每天飼喂3次（09：00、13：00、17：00），自由飲水，并觀察動物的采食和健康狀況。每頭豬試驗期的日采食量為預試期的平均日采食量。

（4） 樣品采集與處理

① 飼料樣品采集   于發酵第1天（即發酵菜籽粕混合物制作完成時）和發酵第5天分別取發酵菜籽粕混合樣，用于測定發酵前后pH、營養和抗營養物質含量；采集代謝試驗用RSM、FRSM及4組試驗飼料樣各30 0g左右，于4℃保存待 測營養成分。

② 糞、尿樣采集   正式試驗期間，采用全收糞尿法，隨排隨收，每天08:00計算前1天的糞樣和尿樣。糞樣按照重量的5％加入10％硫酸，尿樣按照體積的2％加入10％硫酸，將混勻的糞樣和尿樣置于-20℃冰箱保存。試驗結束時，將每頭豬4 d的尿樣混勻，置于-20℃冰箱保存，待測。每頭豬的4 d糞樣混合均勻后，按Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組取樣50％，Ⅳ組全取，于65℃烘干，制備風干樣，待測。

（5） 測定指標及計算方法

①測定指標及方法　 干物質（dry matter, DM）：參照GB/T 6435-2014采用DHG-9246A鼓風干燥箱測定；

粗蛋白質（crude protein ,CP）：參照GB/T6432-1994采用FOSS2300自動凱氏定氮儀測定；

水溶性蛋白質（water soluble protein , WSP）：稱取2 g（精確至0.001 g）樣品置于150 mL三角瓶中，用移液管加入25 mL的pH為6.75±0.05的四硼酸鈉－磷酸二氫鈉緩沖液（緩沖液于39℃水浴鍋中預熱），在39℃下震蕩水浴1 h，用快速濾紙過濾，用移液管取5 mL濾液置凱式管中，然后參照GB/T6432-1994采用FOSS2300自動凱氏定氮儀測定；

酸溶性蛋白質（acid soluble protein, ASP）：準確稱取樣品1 g（精確至0.001ｇ），加入體積分數為15％的三氯乙酸（TCA）溶液溶解并定容至50 mL，靜置5 min后過濾；吸取10.00-25.00 mL濾液，然后參照GB/T 6432-1994采用FOSS2300自動凱氏定氮儀測定；

異硫氰酸酯 （isothiocyanate, ITC）和噁唑烷硫酮（Oxazolidinone, OZT）參考文獻［15］中的紫外法進行檢測；

粗灰分（crude ash, Ash）：參照GB/T 6438-2007測定；

鈣（calcium, Ca）：參照GB/T 6436-2002測定；

磷（phosphorus,P）：參照GB/T 6437-2002采用TU-1901紫外分光光度計測定；

能量（energy）：參照GB/T 213-2008采用6400氧彈量熱儀測定；

氨基酸（amino acid ,AA）：參照GB/T 18246-2000采用L-8900氨基酸自動分析儀測定。

② 待測營養物質消化率計算公式　  飼糧營養物質消化率參照全收糞法計算，公式：

營養物質表觀消化率（％）＝［（食入營養物質-糞中營養物質）/食入營養物質］×100；

無氮飼糧用于估測內源氮和內源氨基酸損失，計算公式：

氮真消化率（％）＝｛［食入氮-（糞氮-內源糞氮）］/食入氮｝×100；

氮表觀利用率（％）＝［（食入氮-糞氮-尿氮）/食入氮］×100；

氮真利用率（％）＝｛［食入氮-（糞氮-內源糞氮）-（尿氮-內源尿氮）］/食入氮｝×100；

氨基酸真消化率（％）＝｛［食入氨基酸-（糞中氨基酸-內源氨基酸）］/食入氨基酸｝×100；

菜籽粕和發酵菜籽粕營養物質消化率通過下面公式計算：

D＝［100×（A-B）/F］＋B；F＝C1×f/［C1×f＋CO×（1-f）］

式中：D為待測飼料中某營養物質的消化率（％）；A為試驗飼糧中某營養物質的消化率（％）；B為基礎飼糧中某營養物質的消化率（％）；F為試驗飼糧營養物質中待測原料營養物質所占的比例（％）；f為試驗飼糧中摻入待測原料的比例；CO為基礎飼糧中某營養物質的含量；C1為待測原料中某營養物質的含量。

（6） 數據統計與分析

采用SPSS 22.0軟件對試驗數據進行統計分析，用LSD法進行差異顯著性比較。分析結果用“平均值±標準誤”表示。

2 結　果

（1） 發酵菜籽粕混合物發酵前后營養物質和主要抗營養因子含量比較

麥麩通常用作固態發酵培養基，一方面為微生物提供碳氮源，另一方面使培養基質地疏松，同時可以吸附住培養基中水分，有利于微生物的生長。本研究按照實驗室所篩選 的發酵菌種和發酵工藝，將RSM與麥麩按7:3的比例混合制作發酵菜籽粕混合物，并比較其發酵前后營養和抗營養物質含量。由表2可知，與發酵前相比，發酵菜籽粕混合物pH由5.60降至3.92，營養物質粗蛋白質、水溶性蛋白質、酸溶性蛋白質和粗脂肪的含量分別提高了1.91％、52.88％、44.40％和24.27％，17種氨基酸含量均有所提高。中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維分別降低了5.21％ 和0.38％；異硫氰酸酯的降解率達到92.20％，噁唑烷硫酮的降解率達到100.00％；單寧和植酸分別降低了35.81％和24.22％。

（2）菜籽粕和發酵菜籽粕的養分消化率

由表3可知，FRSM干物質的表觀消化率較RSM提高10.32％（P＜0.05）；FRSM的消化能較RSM高2.16 MJ·kg-1（P＜0.01）；FRSM的氮表觀（真）消化率和氮表觀（真）利用率極顯著高于RSM（P＜0.01），分別高17.02％（16.40%）和29.43％（27.64％）；FRSM與RSM鈣、磷和粗灰分的表觀消化率差異不顯著（P＞0.05）。

（3）菜籽粕和發酵菜籽粕氨基酸的表觀（真）消化率

由表4可知，發酵菜籽粕氨基酸的表觀（真）消化率均高于菜籽粕，其中兩者半胱氨酸的表觀消化率（真）差異不顯著（P＞0.05），FRSM組氨酸和精氨酸的表觀（真）消化率顯著（P＜0.05）高于RSM，其他氨基酸的表觀（真）消化率均極顯著（P＜0.01）高于RSM；FRSM必需氨基酸中Val、Met、Ile、Leu、Thr、Phe、Lys、His、Arg的表觀（真）消化率分別比RSM高17.72％（16.79％）、26.05％（24.27％）、27.23％（21.71％）、14.68％（17.80％）、63.59％ （58.13％）、14.15％ （13.26％）、73.29％（65.66％）、4.61％ （4.47％）、4.87％ （4.33％）；FRSM的非必需氨基酸Pro、Cys、Ser、Tyr、Glu、Gly、Ala、Asp的表觀（真）消化率分別比RSM高11.08％（11.21％）、2.97％（1.97％）、14.02％（11.88％）、16.48％（15.12％）、10.76％（8.19％）、16.60％（16.12％）、37.69％（31.25％）、33.90％（25.80％）。

3 討　論

（1）發酵菜籽粕混合物發酵前后營養物質和主要抗營養因子含量的變化

菜籽粕中存在大量抗營養因子是限制菜籽粕在畜禽日糧中大量應用的主要因素。研究表明，通過發酵處理菜籽粕可降低其抗營養因子含量，改變菜籽蛋白結構，并能增加菜籽粕中多肽、有機酸等益生物質的含量，有效改善菜籽粕的營養價值。本研究中，發酵菜籽粕混合物通過發酵，其pH降至4.0以下，酸度增加，營養物質粗蛋白、水溶性蛋白質、酸溶性蛋白質、粗脂肪以及17種氨基酸含量均得到不同程度地提高，與上述研究結果一致。在本試驗中，采用篩選的短乳桿菌和短小芽孢桿菌雙菌固態發酵菜籽粕，異硫氰酸酯和嗯唑烷硫酮降解率高達92.20％和100.00％，具有較強的降解作用，這與胡永娜等研究結果一致。胡永娜等采用枯草芽孢桿菌、產朊假絲酵母和糞腸球菌混合發酵菜籽粕，結果發現，異硫氰酸酯和噁唑烷硫酮的降解率分別高達96.20％和83.13％。付敏等采用枯草芽孢桿菌、黑曲霉和白曲霉復合發酵菜籽粕，結果發現硫苷降解率高達93.53％，噁唑烷硫酮全部被降解。孫林等選用6％植物乳桿菌、6％蠟樣芽胞桿菌、2％酪酸羧狀芽孢桿菌和6％枯草芽孢桿菌，34℃發酵2ｄ時，菜籽粕中植 酸的降解率高達90.15％，單寧降解率達98.17％。在本試驗中，短乳桿菌和短小芽孢桿菌雙菌對菜籽粕單寧和植酸的降解能力較低，分別為35.81％ 和24.22％。這可能與發酵所用菌種、發酵基質中含水量、pH、溫濕度等多種因素有關。

（2）菜籽粕和發酵菜籽粕的常規養分消化率

本研究結果表明，FRSM較RSM極顯著提高了氮表觀（真）消化率和氮表觀（真）利用率，與Vig和Walia研究 證明，微生物發酵可以提高RSM蛋白質消化率的結果一致。這是因為微生物利用其龐雜的微生物區系和復雜的微生物酶系，對RSM的抗營養成分及酶解底物進行發酵分解，有效降低了抗營養因子的含量，同時微生物在發酵過程中其數量經適應期、對數生長期、穩定期后大幅度增加，分泌大量的胞外酶分解發酵基質，在蛋白酶作用下將大分子球蛋白質降解為易于消化吸收的小分子蛋白（如水溶性蛋白質和酸溶性蛋白質）、小肽、寡肽等物質，提高氮的利用率。此外，微生物在發酵過程中，還可以利用其降解產物或外界物質（如培養基中的碳源和氮源）將非蛋白氮合成菌體蛋白，提高蛋白質的含量，引起蛋白質消化率升高。本研究結果表明FRSM干物質的表觀消化率顯著高于RSM，這與付敏等、Shi等和Xu等通過固態混菌發酵菜籽粕（餅）的結果一致。這可能是通過微生物發酵降低了可溶性非淀粉多糖在消化道食糜的粘度，增加內源酶的擴散，提高了酶與養分的接觸面積，同時微生物分泌的纖維素酶、木聚糖酶和葡聚糖酶通過協同作用，破壞植物性飼料的細胞壁，使被細胞壁包裹的大分子營養物質充分釋放出來被消化利用，從而促進了干物質的利用，提高干物質的消化率。本研究結果表明，FRSM的消化能極顯著高于RSM，可能是因為RSM在發酵過程中產生的活性肽類物質可以提高豬的采食量，從而提高消化能。另外，纖維素占RSM中總多糖含量的24.1％，固態發酵過程中部分中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維被降解，使其沒有完全在豬腸道中發酵，導致FRSM中可發酵糖的濃度增加，從而提高了FRSM的消化能。

（3）菜籽粕和發酵菜籽粕氨基酸的表觀（真）消化率

本研究結果表明，FRSM氨基酸（除半胱氨酸）消化率均顯著或極顯著高于RSM。這是因為RSM中含有GS、單寧、植酸和纖維等抗營養因子。首先，GS在芥子酶作用下會產生OZT、ITC等有毒物質，降低飼料適口性，引起甲狀腺腫大，降低營養物質的消化吸收。其次，研究表明單寧含量與必需氨基酸和非必需氨基酸的消化率之間存在顯著的反比關系。Jansman等給大鼠飼喂富含單寧  的蠶豆克，結果表明隨著單寧含量的不斷增加，大鼠糞便中必需氨基酸（r2＝0.97）和非必需氨基酸（r2＝0.27～0.99）的表觀消化率呈線性下降，且必需氨基酸的消化率受到的影響程度低于非必需氨基酸，特別是脯氨酸、甘氨酸和谷氨酸。據推測，氨基酸消化率顯著降低可能與膳食單寧與腮腺分泌的富含脯氨酸的蛋白質和內源蛋白質的相互作用，降低胃蛋白酶，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶和腸道刷狀緣肽酶的活性有關。再者，植酸與蛋白質結合形成的二元復合物會抑制胃腸道蛋白酶對蛋白質的水解作用，降低蛋白質的消化率。Antony和Chandra通過發酵處理小米粟，其植酸含量降低23％～26％，胃蛋白酶和胰 酶對小米粟蛋白的體外消化率提高了14％～26％。另外，通過補充微生物植酸酶釋放肌醇六磷酸結合蛋白，也可以提高蛋白質/氨基酸的消化率和利用率，尤其對蘇氨酸消化率的改善最大，這與本試驗蘇氨酸消化率提高幅度最大的結果一致。除此之外，纖維含量過高也會降低蛋白質和氨基酸的消化率，水溶性纖維的膠凝和粘度特性減少腸內容物的混合，阻斷酶-底物的相互作用，形成營養吸收的生理屏障，從而降低了營養物質的消化和吸收。本研究通過短乳桿菌和短小芽孢桿菌雙菌固態發酵RSM，其纖維、抗營養因子含量和物質結構發生變化，抗營養因子含量顯著降低，降低了不溶性纖維和抗營養因子對氨基酸消化率的不良作用，同時通過微生物發酵增加了酸溶性蛋白質、水溶性蛋白質和游離氨 基酸的含量，從而顯著提高了FRSM氨基酸的表觀（真）消化率。

4 結　論

本研究通過雙菌固態發酵降低了菜籽粕抗營養因子的含量，改善了菜籽粕的飼用品質，提高了菜籽粕在育肥豬上的養分消化率和利用率。

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